Каналы из молекул

Молекулярная биология — фаворит биологических наук. В прошлом она изучала строение и функцию нуклеиновых кислот и многих белковых ферментов. Сейчас эта наука стоит на пороге новых важных открытий. Одна из главных проблем на повестке дня — ионные каналы. Тут — ключ к пониманию того, где и как возникают нервные импульсы, те самые, которые передают в наш мозг все сведения о мире и, наоборот, доносят посылаемые мозгом сигналы к нашим мышцам.

Природа сигналов мозга и механизмы их генерации были окончательно установлены семьдесят лет назад. Лидеры этих исследований — английские ученые Ходжкин, Хаксли и Катц — стали лауреатами Нобелевской премии. Ходжкину и Катцу было, кроме того, присвоено почетное рыцарское звание. Тем самым их заслуги были поставлены в один ряд с успехами Ньютона, Резерфорда и квартета «Битлз».

Результаты этих, успевших стать классическими, исследований известны теперь даже школьникам, поэтому можно позволить себе изложить их в кратком виде:

В организме человека и животных работает идеальная электрическая связь, клетки мозга передают сообщения импульсами электрического тока. Нервные импульсы распространяются по нерву помощью молекулярных ретранслирующих генераторов. Эти генераторы расположены в мембране нервного волокна, толщина которого всего десятичная часть миллиметра. Генераторы живой клетки – ионные, в их работе используется различие ионного состава снаружи и внутри клетки. Ионные токи создают нервный импульс и позволяют ему распространятся вдоль нервного волокна.

Перед современными исследователями стоят два основных вопроса: молекулярная структура ионных генераторов и принципы их работы. Чтобы ответить на них, требуются объединенные усилия ученых разных специальностей.

Путь для ионов

Известно, что во время нервного импульса мембрану пересекают ионы натрия и калия. Встает вопрос, как они это делают. В разное время были предложены две гипотезы. Согласно первой из них, ионы могут пересекать мембрану с помощью специальных молекул-переносчиков. Это напоминает перевоз пассажиров в лодке через реку. Молекулы-переносчики движутся от одного края мембраны к другому, захватывая с собой определенные ионы, «билетом» для иона могут служить его размер и заряд. Другая гипотеза предсказывает существование в мембране специальных отверстий — каналов. Это молекулярный туннель для иона, прошивающий мембрану насквозь. Но мембрана не всегда одинаково проницаема для ионов. Ионы натрия идут через нее в основном во время нервного импульса. Значит, в канале есть «ворота» и механизмы, эти «ворота» открывающие и закрывающие.

Сейчас ясно, что существуют и переносчики ионов, и каналы. Но для объяснения натриевой проницаемости нервных клеток гипотеза о каналах кажется более правдоподобной. Немалая заслуга в этом принадлежит тетродотоксину — яду, выделенному из скалозубых рыб. Рыбы эти живут во всех теплых морях.

Одним из первых европейцев, описавших симптомы отравления скалозубой рыбой, был известный английский мореплаватель Джеймс Кук. В 1774 году его корабль стоял неподалеку от острова Новая Каледония. Туземцы продали морякам неизвестную рыбу. Кука спасла любознательность двух сопровождавших его натуралистов: они так долго описывали и зарисовывали неизвестную науке рыбу, что на стол ее подали только поздно вечером, когда есть уже не хотелось, и к ужину едва притронулись.

Молекула-пробка

Выделить тетродотоксин в чистом виде удалось только в 1950 году. Его структура теперь детально изучена. Отравление тетродотоксином связано с нарушением передачи нервного импульса. Действие яда очень специфично. Он не дает ионам натрия проникать внутрь клетки, не влияя на поток ионов калия. Это говорит о том, что пути через мембрану для этих ионов различны. Тетродотоксин — необычайно сильный яд: один миллиграмм его может убить семь тысяч мышей. Удалось рассчитать, какому количеству ионов натрия закрывает путь одна молекула тетродотоксина. Цифра получилась столь большой, что объяснить ее можно только с помощью «канальной» гипотезы.

Каким образом действует яд скалозубых рыб? Обратила на себя внимание гуанидиновая группировка, которая входит в молекулу тетродотоксина. Известно, что ионы гуанидина способны проходить через натриевый канал. Возможно, похожий на гуанидин участок молекулы яда тоже проникает внутрь канала, но остальная часть молекулы столь велика, что застревает в канале и крепко прилипает к его входу — примерно так, как слегка подкрепившийся Винни-Пух застрял, выходя из дома Кролика.

По числу «застрявших» молекул тетродотоксина определили количество каналов для натрия. В разных нервных волокнах оно было разным — от трех до 75 каналов на площади в один квадратный микрон. Тетродотоксин был «первой ласточкой». Сейчас ядов — инструментов для исследования структуры ионных каналов — известно довольно много. Один из них «подарила» ученым маленькая колумбийская лягушка. Ее яд — батрахотоксин — ломает «ворота» натриевых каналов: после обработки этим ядом они уже не могут закрыться. Через открытый батрахотоксином канал начинают идти ионы, размеры которых превышают размеры ионов натрия. Этот результат говорит о тесной связи между воротами канала и его способностью избирательно пропускать ионы.

Ажурная корзина

Какие молекулы могут выполнять функцию каналов или переносчиков? Понять это помогают искусственные бимолекулярные мембраны, которые в существенных чертах похожи на мембраны живых клеток.

По данным современной науки, клеточные мембраны в основном состоят из белков и жироподобных веществ — липидов. Молекула липида имеет два конца. Один из них «любит» воду — образует с ее молекулами водородные или дипольные связи. Эта часть молекулы легко растворяется в воде и плохо — в жирах. Другой конец воду «не любит» и всегда стремится от нее прочь. Такие структуры, наоборот, хорошо растворимы в жирах. Поэтому в мембране липиды лежат в два слоя — убегающие от воды концы собираются вместе. Полярные же концы обращены к водным растворам: один наружу, а другой внутрь клетки. Эта бимолекулярная структура составляет основу мембраны. В нее с двух концов частично погружены молекулы белков. Но есть и такие белки, которые пронизывают мембрану насквозь.

Большая часть липидов мембран клеток животных содержит фосфор. Фосфолипиды можно извлечь с помощью специальных растворителей и нанести под водой на дырочку в тефлоновой стенке. На отверстии получается плоская тонкая мембрана. В ней, так же как в мембране живой клетки, два слоя фосфолипидов. Поэтому она называется БФМ — бимолекулярная фосфолипидная мембрана. В БФМ нет белков, нет и ионных каналов. Ионы натрия и калия такая мембрана не пропускает.

Как же тогда заставить искусственную мембрану их пропускать? Это можно сделать с помощью некоторых антибиотиков или молекул, синтезированных по их образу и подобию. Одни антибиотики действуют как переносчики ионов. Например, молекула валиномицина имеет структуру типа «корзиночки». Когда в нее попадает ион калия, корзиночка захлопывается вокруг него, и тогда внутрь нее упаковываются полярные отрицательно заряженные кислородные группы валиномицина, а наружу выступают слабо взаимодействующие с водой части. После такой перестройки молекула переносчика легко переходит из водного раствора в жирную мембрану. Таким образом, антибиотик валиномицин вначале заменяет иону калия водную оболочку, а затем переносит его через мембрану.

Эта корзиночка-переносчик устроена очень точно — другие ионы, например ионы натрия, упаковываются в нее плохо. Молекула, может быть, и рада их перевезти, но не способна заменить ионам натрия диполи воды, с которыми они прочно связаны электрическими силами. Синтез, изучение структуры и механизма работы гениально сконструированной Природой молекулы валиномицина — выдающееся достижение ученых.

Время жизни канала

Особый интерес представляют антибиотики, сооружающие в мембране заполненную водой или подогнанную для ионов пору. В последнее время техника измерений достигла такого совершенства, что позволяет уловить, насколько изменяется электрическое сопротивление БФМ, когда в нее встроен только один канал. Такие измерения привели к одному из самых удивительных открытий наших дней. Оказалось, что сопротивление искусственной фосфолипидной мембраны с одним каналом меняется скачками. Это связано с тепловым движением молекул, образующих канал. Например, молекула антибиотика грамицидина А двигается в мембране, время от времени прошивая ее насквозь. Ионы должны ловить момент, когда канал открыт. Это время называют «временем жизни канала».

Проводимость мембраны, содержащей много молекул аломитицина, зависит от разности потенциалов на мембране. Англичане Хейден и Гладки показали, что электрическое поле на мембране меняет не проводимость одиночного канала, а только время его жизни. Быть может, и у каналов живых клеток «время жизни» зависит от электрического потенциала, и именно тут надо искать причину генерации нервного импульса?

Чтобы создать один канал из нистатина, нужно иметь десять молекул этого антибиотика. Из пяти молекул строится половинка канала. По ней ион может пройти только до середины мембраны. Нистатин плохо проникает через мембрану, поэтому его надо добавлять с обеих сторон БФМ. Половинки канала сходятся — путь для иона готов. Так же иногда поступают при строительстве дороги: начиная с двух конечных пунктов, строители встречаются посредине.

Ловцы каналов

Но понять, как устроена ионная проницаемость нервных клеток, можно, лишь выделив ионный канал из клеточной мембраны. А это сложная задача: липиды прочно удерживают белковые молекулы. Мембрану приходится разрушать. Обычно ее растворяют детергентами. Начинается самое трудное. Такой раствор по разнообразию содержащихся в нем белков во много раз превышает ассортимент большого магазина и вдобавок товары не разложены аккуратно по полочкам, а собраны в кучу и тщательно перемешаны. Попробуй в этом хаосе найти нужную тебе вещь, тем более, когда не слишком хорошо представляешь, как она выглядит…

Вначале придумали, как выделять каналы из так называемых синаптических мембран. Синапс — это место контакта между аксоном и нервной или мышечной клеткой. Аксон выделяет специальное вещество — медиатор. Медиатор доходит до соседней клетки, связывается с рецептором и открывает ионные каналы. Возникла идея — извлечь канал из раствора с помощью медиатора.

Длинную тонкую стеклянную трубку набивают крупинками из полимера. К стенкам крупинок прикреплены молекулы, напоминающие медиатор. Часто эти «подставные» молекулы имитируют только часть медиатора. Через трубку пропускается раствор белков мембран. Молекулы рецептора не могут пройти мимо — принимая искусственный медиатор за настоящий, они прочно с ним связываются.

Следующий этап — реконструкция канала. Выделенный с помощью «медиаторов» белок встраивают в бимолекулярную фосфолипидную мембрану. Представьте себе состояние рыбака, вытаскивающего леску из воды. Еще минута, и станет ясно, какова добыча,— то ли золотая рыбка, то ли старый башмак. То же самое испытывают исследователи, когда проверяют «выловленный» канал — как он меняет сопротивление БФМ, какие ионы пропускает, что руководит его проницаемостью. Сравнив полученные результаты с характеристиками канала нервной клетки, определяют, сколь успешно прошло выделение.

В течение нескольких лет многие лаборатории мира занимаются выделением каналов, открываемых медиатором ацетилхолином. Достижения в этой области велики, но полного успеха никому добиться не удалось: действие некоторых фармакологических веществ на естественный и выделенный канал оказалось разным. Десятки лабораторий пытаются сегодня выяснить причины этого не вполне удачного выделения и реконструкции канала.

Ядовитая приманка

Основные усилия ученых направлены на изучение натриевых каналов аксонов. Еще никто в мире не выделил даже слабое подобие такого канала. А ведь именно эти образования играют главную роль в генерации нервного импульса. Как же к такому каналу подступиться? Медиаторов, которые открывают каналы синаптических мембран, здесь нет. Ответ, тем не менее, прост. Канал можно выделить с помощью яда. Яд нарушает работу канала, прочно связываясь с образующей канал молекулой. «Потянув» за молекулу яда, можно вытащить и канал.

Яд, полученный из змей и насекомых, состоит из многих компонентов. Поэтому целый яд обладает разнообразной биологической активностью. Различные тесты позволяют составить нечто вроде рабочей характеристики яда: множество граф, заполненных цифрами, знаками и словами. После такой проверки яды получают путевку в жизнь. Теперь их надо расчленить на отдельные компоненты и выделить те из них, которые действуют на натриевые каналы.

Из яда скорпиона выделили одиннадцать нейротоксинов — фрагментов яда, действующих на нервную систему. Все они оказались небольшими белками: в их составе не более 60 — 70 аминокислот. У двух токсинов уже расшифрована первичная структура — последовательность, в которой связаны друг с другом аминокислоты.

Автор: С. Минина.