Деление клетки

В романах все получается проще, чем в жизни. Вот как описывает зарождение жизни на Земле писатель Килгор Траут, герой «Завтрака для чемпионов» Курта Воннегута.

Сначала Создатель населил мир роботами. Потом они ему надоели, и он решил сделать существо, обладающее свободной волей. Сказано — сделано: появляется Человек. В его честь Создатель закатывает банкет в гостинице «Уолдорф Астория». Под утро Человека переносят на девственную планету и, пока он отсыпается, соскребывают с его ладоней горсть клеток. Клетки высыпают в супообразное море, и начинается эволюция. Проходят века, клетки превращаются в организмы. И все они, подобно Человеку, обладают свободной волей.

Насчет свободной воли и супообразного моря — не придерешься. С банкетом — куда ни шло, хотя какой-нибудь старомодный генетик мог бы выразить сомнение: не повредит ли потомству? Но соскребывание с ладоней! Совершенно неправдоподобная деталь. Ни в жизни (in vivo), ни в пробирке (in vitro) ничего путного из таких клеток не выйдет. Соскребывают — это верно, но не с ладоней. С чего соскребывать — это было загвоздкой для целого поколения биологов, пожелавших заставить клетку жить полнокровной жизнью вне родного организма.

Биологи уже давно выяснили, что жизненные процессы в организме зависят от поведения клеток. Чем больше узнаешь про клетку, тем больше узнаешь про организм. Но как ее изучать? Пока она входит в состав организма, разглядеть, что в ней происходит, почти невозможно. А если и разглядишь, придется долго соображать, что произошло по инициативе самой клетки, а что — по приказу свыше. Лучше всего изолировать ее от организма и пересадить в искусственную среду. Во-первых, клетка все-таки попроще организма. Во-вторых, на клетки можно воздействовать и так и сяк, а все эти воздействия, равно как и их последствия, — контролировать. Что касается растительной клетки, то от нее ожидали самого интересного. Немецкий ботаник Гёбель высказал предположение, что любая растительная клетка — это в потенциале целое растение. Если ее удастся изолировать и освободить от подчинения организму, все заложенные в ней возможности проснутся и она сами сможет превратиться в организм.

Предположение, когда его перевели на язык генетики, оказалось пророчеством. Выяснилось, что клетка сохраняет всю наследственную информацию, свойственную ее виду, и что эту информацию можно иногда пробуждать и реализовать в любом направлении. Но выяснилось это, правда, не сразу, первые клетки, которые удалось заставить жить в пробирке, были клетки животных. Все они оказались способны к делению, но ни одна из них, откуда бы ее ни брали, не превращалась в организм. Клетки настолько специализировались, что вернуть им утраченную свободу воли было уже невозможно.

С растительными же клетками пришлось повозиться: взятые от растения без разбору, они поначалу не желали даже делиться. Но это не обескуражило исследователей. Они решили продолжить опыты с меристемой — тканью на кончике корня и в почке будущего ростка. Она-то уж специально предназначена для деления и роста. И вот первый успех: взятые от меристемы клетки стали жить в пробирке.

Это было в 1922 году. А лет через десять нашли более удобную для экспериментов ткань — паренхиму, из которой, состоят клубни, мясистые корни, плоды и стебли растения. Кусочки любой ткани, будь то меристема или паренхима, помещенные в пробирку, превращались через неделю в каллус. Каллус, что в переводе с латыни означает мозоль, — это наплыв, вырастающий там, где растению нанесли какую-нибудь рану.

Возможности этой рыхлой массы, растущей не по дням, а по часам, оказались поистине безграничны, ибо клетки ее либо потеряли, либо еще не приобрели специализацию. Чтобы сохранить каллусные клетки, часть их надо время от времени пересаживать на свежую среду. Занятие это немного раздражает экспериментаторов, но все окупается вдохновляющим результатом: культура ткани может жить ровно столько, сколько будет существовать наука физиология растений. Французский исследователь Готре вырастил из ткани морковки штамм каллусных клеток. Клетки этого штамма благополучно здравствуют во многих лабораториях мира; они так же свежи и так же оранжевы, как и в младенчестве. Заметим попутно, что сейчас для получения каллусной ткани уже не обязательно наносить клеткам телесные повреждения: достаточно подействовать на любую клетку гормонами в особой комбинации, и она превратится в каллусную.

Кое-что они все-таки помнят

Потеря специализации при переносе клетки в пробирку означает, что ее генетический аппарат претерпел грандиозную встряску, а сама клетка начала совершенно новую жизнь. В самом деле, представьте себе клетку, которая принадлежала когда-то листу. В те времена весь ее аппарат был настроен главным образом на фотосинтез: гены, находящиеся в ядре и ответственные за фотосинтез, работали активнее других. Но вот клетка оказалась в пробирке. Теперь гены фотосинтеза сойдут со сцены и уступят место генам, отвечающим за размножение. Вслед за этой переменой меняется и весь спектр структурных и ферментных белков.

Как выяснилось, этими изменениями руководят гормоны. Их и вводят в среду, чтобы получить каллусную массу и поддержать ее рост. Причем важно не только количество гормонов, но и соотношение их в питательной среде. Попробуем разобраться в том, как все что происходит.

Сотрудница лаборатории культуры тканей и морфогенеза Н. Н. Дмитриева рассказывает о проведенном ею эксперименте:
— Я взяла у стебля табака кусочек ткани, поместила его на питательную среду и стала действовать на клетки растительными гормонами — ауксином и цитокинином. Задача была в том, чтобы понять, какую роль играет ауксин, а какую — цитокинин. Поэтому пришлось вводить в среду и оба гормона вместе, и каждый в отдельности.

Выяснилось, что в игре они должны участвовать оба, но назначение их разное и вступают в игру они по очереди. Ауксин готовит клетку к делению. Под его воздействием разрыхляется оболочка клетки, увеличивается число тех клеточных органелл, которые готовят деление, и, наконец, происходит основное событие — репликация ДНК. Но если в среде нет цитокинина, на этом все и кончается. Клетка будет расти, но не примет «решения» делиться. Чтобы заставить ее делиться, необходим цитокинин. Он как бы включает подготовленное ауксином деление.

Таков механизм двойного гормонального контроля за делением клеток. Как действуют гормоны на генный аппарат — пока еще точно неизвестно. Это область непознанного — гипотез и догадок.

Все каллусные клетки похожи друг на друга, и различают их не по виду, а по ярлычкам. Сходны и некоторые их биохимические характеристики. Как установили биологи, у клеток, полученных, например, из семян льна и из тканей стебля табака, одинаково увеличивается доля насыщенных жирных кислот, что как раз и свойственно одноклеточным организмам. Весь обмен веществ в этих клетках, направленный на поддержание их размножения и роста, приобретает архаические черты. Общие черты найдены и у живущих в суспензии клеток явора и клеток дрожжей.

Любопытная подробность: в процессе потери клеткой своей «профессии» среди новых белков в ней появляется белок, очень похожий на один из белков уже знакомой нам меристемы. Это может означать только одно: активизацию структурного гена, который пребывал в подавленном состоянии, когда клетка приобретала специализацию.

Обыкновенно каллусные клетки почти бесцветны. Но среди этих рыхлых бледно-кремовых комочков вам вдруг бросается в глаза ярко-зеленое пятно. Что это? Тоже каллусная ткань — от ели. И не от иголок, а от корня. Вот оно, доказательство сохранения генетического потенциала! Воздействуя на клетку корня особой комбинацией гормонов, экспериментатор активизировал те самые гены, которые ответственны за фотосинтез. Вопреки всем преображениям каллусные клетки все же не расстаются со своим прошлым. В них причудливо сочетаются свойства тканей, из которых они были изъяты, признаки вида и новые особенности, связанные с существованием уже на новом уровне — вне организма.

Генетической памятью можно воспользоваться в практических целях. Например, сохранить в клеточных культурах наследственный потенциал многих редкостных или обреченных на вымирание растений. Или биосинтетический потенциал: клетки синтезируют не только то, что нужно им самим, но и так называемые вещества вторичного обмена, которые нужны целому растению и которыми оно давно делится с человеком. Это — алкалоиды, гликозиды, фенольные соединения, эфирные масла, смолы, стероиды, ингибиторы. Вырабатывая эти ценные вещества, клетки выделяют их в питательную среду. Бери и пользуйся!

Чаще всего клетки, живущие в пробирке, не в силах накопить этих веществ столько, сколько собирается их в запасающих органах растения. Но, во-первых, «выход» этих веществ можно увеличить, действуя на клетки мутагенами и получая более продуктивные мутанты, а, во-вторых, клетки размножаются так быстро, что жалеть об их невысокой продуктивности даже не приходится. Особенно если речь идет о редких видах, например о раувольфии змеиной — единственном источнике резерпина, о диоскорее, поставляющей нам стероиды, или о знаменитом женьшене. Кстати, клетки женьшеня — счастливое исключение из правила: драгоценных тонизирующих веществ они содержат не менее, чем сам корень. В естественных условиях корень женьшеня прибавляет только по грамму в год. А клетки за три недели образуют солидную массу — 400 граммов на литр среды. Похоже на то, что романтической профессии искателей женьшеня может прийти конец.

Мне показали две корзины садовой земляники одного и того же сорта. В первой — ягоды крупные, в другой — мелкие, чахлые. В чем же дело? Объяснение довольно просто. В первой корзине ягоды со здоровых кустов, а во второй — земляника, пораженная вирусом.

Особенно опасны вирусы для культур, размножаемых отводками, черенками и клубнями: вместе с посадочным материалом вирус переходит из поколения в поколение. Борьба с этим недугом осложняется тем, что живет вирус в самой клетке растения. Уничтожишь вирус — погубишь и саму клетку.

Впрочем, ученые заметили, что вирусы обходят стороной верхушечную меристему — точку роста в верхушке растения. И вот маленький кусочек меристемы помещают в жидкую среду, из кусочка получается бесформенная масса, а из массы вырастают почки, сотни почек. Почки развиваются в побеги, побеги укореняются, и лаборатория превращается в волшебный питомник крошечных орхидей. Как утверждают французские исследователи, из одного стебля орхидеи можно получить за год почти два миллиона этих прихотливых растений. У такой орхидеи вирусов нет.

Цитоняня

Как правило, исследователь стремится к тому, чтобы выращиваемая им популяция клеток была генетически однородной. А этого можно добиться, если выращивать культуру не из кусочка ткани, а из отдельной клетки. Казалось бы, чего проще! Однако выяснилось, что клетка тяготеет к обществу и соглашается делиться лишь в том случае, если неподалеку от нее будут другие клетки. Словом, на единицу поверхности среды должно приходиться определенное количество «жителей», а между ними — существовать какая-то связь. Не выделяют ли клетки в среду какое-нибудь вещество, которое побуждает соседей к делению?

Американский исследователь Хильдебрандт вылавливал клетки из суспензии и каждую высаживал на среду отдельно. Клетки не делились. Тогда он поместил их на кусочек фильтровальной бумаги, который соприкасался с быстроразмножающейся группой клеток того же вида. Клетки начали делиться. Когда из них получились маленькие колонии, их перенесли на агар. Популяция, заставившая клетки делиться, напучила название ткани- няньки.

Но как же она их все-таки заставила? За последние годы столько было разговоров о том, как клетки обмениваются информацией, что оставить вопрос открытым было просто неприлично. Между клеткой и нянькой стали воздвигать разные преграды. Стекло оборвало всю сигнализацию. Полупроницаемая пленка замедлила переход к делению. Промокашка — не преграда вовсе! Итак, химическое вещество. Судя по действию преград, это полипептид, или белок с низким молекулярным весом. Но зачем он нужен клетке? Может быть, он играет роль побуждающего к делению гормона?

Такая же химическая связь-сигнализация помогает клеточной популяции восстанавливать нарушенное равновесие. Если подвергнуть ее воздействию гамма-лучей, причем подействовать ими только на те клетки, которые уже делятся или собираются делиться, число делений резко сократится, но потом столь же резко возрастет. Плодиться начнут теперь те члены компании, что до облучения вовсе не были к этому склонны. Неведомым еще, но, несомненно, химическим путем зараженные клетки сообщили здоровым: «Нас вывели из строя, заменяйте нас!».

Новая жизнь

Рассказывая о жизни клеток, мы часто упоминали о гормонах. Им принадлежит главная регулирующая роль в жизни клеток, как, впрочем, и в жизни целого растения; без них не будет делиться ни клетка, нуждающаяся в няньке, ни сама нянька.

А нельзя ли использовать гормоны не только для регулировки деления, но и для более серьезных перестроек в клеточных популяциях? Клетка, живущая в пробирке, уже не принадлежит своему органу-предку: гены, вынуждавшие ее работать на этот орган, выключены. Но они продолжают существовать, как существуют вообще все ее гены. Отчего бы не вернуть их с помощью тех же гормонов к прежним обязанностям и превратить группу клеток в орган — корень, стебель, лист, почку?

Среди первых попыток создать из неспециализированной ткани орган растения, то есть вызвать искусственный морфогенез, поучителен эксперимент, принадлежащий профессору Гарвардского университета Вэтмору. В его лаборатории решили сконструировать из клеточной культуры проводящую систему растения. По этой системе из корня в стебель движутся питательные вещества, а из листьев — продукты фотосинтеза. Складывается она из сосудов, предназначенных для перекачки воды и солей (ксилема), и из ситовидных трубок, по которым движутся органические вещества (флоэма). Вэтмор предположил, что превращением клеток в элементы ксилемы и флоэмы командуют гормоны, вырабатываемые меристемой. В массе каллусных клеток сделали v-образный вырез и вставили в него верхушечную почку с зачатками листочков. Почка осталась жить, а клетки под вырезом стали превращаться в элементы проводящей системы.

Предположение насчет гормонов меристемы подтвердилось. Теперь можно было попытаться заменить почку активными веществами, вырабатываемыми клетками меристемы. Вещества действовали неодинаково. Когда в вырез вводили уже знакомый нам гормон ауксин с сахарозой высокой концентрации, из каллусных клеток получались элементы флоэмы, а когда с сахарозой низкой концентрации — ксилемы.

Когда исследователи перешли от проводящей системы к конструированию стеблей и корней, обнаружилась еще одна закономерность. Если содержание вводимых в среду гормонов более или менее сбалансировано, каллусная ткань растет не дифференцируясь. А если сдвинуть этот баланс в сторону, жди дифференцировки. Преобладает в среде ауксин — образуется корень; преобладает цитокинин — стебель. Меняя соотношение гормонов, морфогенез можно направить в любую сторону. Можно сделать и так, чтобы каллусная клетка дала начало не органу, а зародышу целого растения.

Другими словами, ее превращают в такую клетку, которая функционально подобна оплодотворенной яйцеклетке — зиготе, хоть и получается от деления не половых, а соматических клеток. Потому подобный эмбриогенез именуется соматическим.

Список вопросов, занимающих исследователей, неизмеримо больше списка полученных ответов. Когда заведующая лабораторией культуры тканей и морфогенеза Р. Г. Бутенко рассказывает о своих опытах или об опытах своих коллег, она не устает повторять: «Пока нам лучше удается контролировать морфогенез, чем объяснять его. Большинство объяснений — гипотезы. Область непознанного здесь значительно превосходит то немногое, что уже известно».

Естественно, идет поиск. Поиск таких подходов, что помогли бы преодолеть пропасть между теми событиями в клетке, которые описываются в терминах молекулярной биологии, и изменениями, которые происходят с нею как с самостоятельным организмом или элементом какого-то целого.. Эта пропасть будет существовать до тех пор, пока не станут ясными связи между разнообразными элементарными процессами, от которых зависит появление органов растения. Преодолеть же ее очень важно, так как именно здесь частная проблема выращивания изолированных растительных тканей сопрягается с основным вопросом современной биологии — вопросом о том, как возникло разнообразие живого.

Раиса Георгиевна считает одним из самых многообещающих направлений поиска выявление и исследование растений-мутантов — таких «калек», которые бы имели поломки, препятствующие процессу образования органов на разных его стадиях. Будучи организмами, они обычно не выживают, в культуре же in vitro могут существовать как угодно долго.

Вот перед нами ряд пробирок с такими «калеками». Это — растения табака. Впрочем, растениями их можно назвать условно: у одних нет стебля, у других — корня, у третьих — листьев. Если высеять клетки от этих растений и получить разные культуры, в каждой из которых сохранялся бы один какой-нибудь характерный блок-поломка, то исследователь, имея дело с такой цитотекой неудач природы, получит материал, помогающий ему разобраться в биохимических причинах этих неудач и найти критические моменты, ключевые точки в нормальном процессе морфогенеза.

И опять вопросы. Какова в каждом конкретном случае причина отклонений, наблюдающихся у этих растений? Что это, поломка генетического аппарата или стойкое репрессирование ответственных за морфогенез генов, которое просто не удается снять?
Или тот же самый вопрос в несколько ином варианте: почему клетки, долго живущие в пробирке, теряют способность к морфогенезу?

Чтобы найти ответы на эти вопросы, скрещивают клетки из штамма, потерявшего способность к морфогенезу, с клетками, взятыми из растения, способного к этому процессу. Подбирая штаммы из цитотеки «уродцев», у которых по-разному и на разных стадиях сломана или заблокирована способность к органотворению, можно попытаться заставить клетку рассказывать о движущих силах в ней на всех этапах ее превращении.

Но можно ли скрещивать клетку с клеткой, да еще таким хитроумным способом? Можно, если иметь дело с протопластами — «раздетыми» клетками. Раиса Георгиевна считает изолированные протопласты одним из самых интересных и перспективных методов исследований, причем как с теоретической, так и с практической точки зрения. Как мы сейчас убедимся, это действительно так.

Разрушение «деревянной тюрьмы»

В отличие от животной клетки растительная заключена в прочную целлюлозно-пектиновую оболочку, «деревянную тюрьму», как назвал ее одни исследователь. У соседей по ткани эти оболочки связаны друг с другом, и сами клетки, таким образом, прочно скреплены между собой. Вот почему их так трудно «соскабливать». Разрушить «тюрьму» можно кислотой, но вместе с нею тогда погибнет клетка. Способ, при котором «тюрьма» разрушается, а «арестант», именуемый протопластом, то есть клеткой без оболочки, выходит на свободу целым и невредимым, придумал англичанин Кокинг.

Клетки обрабатывают смесью двух ферментов: один из них разрушает пектиновые вещества, а другой — целлюлозу. Ферменты эти выделяются микроорганизмами, например плесенью, вырастающей на хлебе. Богат ими и желудочный сок виноградной улитки, питающейся листьями лозы.

Освобождение из деревянной тюрьмы связано с большими хлопотами. Надо найти подходящую концентрацию ферментов, добавить к ним вещества, которые вызвали бы обезвоживание клетки: протопласт должен сжаться в комочек, чтобы рушащиеся стены не задели его. Потом протопласт надо отмыть от фермента и особыми веществами уравнять внутреннее и внешнее давления, иначе окружающая его топкая мембрана разорвется. Все это отдаленно напоминает хлопоты с водолазом, которого поднимают с большой глубины на поверхность.

Но бремя свободы не по силам бывшему «арестанту». Едва попав на питательную среду, протопласт стремится опять превратиться в клетку. Через три дня он снова выстраивает вокруг себя «деревянную тюрьму», такую же прочную, как и прежняя, а спустя две недели перед нами уже не одна, а целая колония клеток.

Однако в распоряжении экспериментатора есть своеобразное окно во времени — эти самые три дня, когда он имеет прямой доступ к клетке и может вмешиваться в ее интимную жизнь.

Проделывать подобные операции удается, конечно, не со всеми растениями. Лучше всего это получается у разных сортов табака и его родственников. Клетки этого рода вообще легко переселяются в пробирку и превращаются во все, чего от них ни потребуют. Другие растения сопротивляются такому насилию. До сих пор ни от злаковых, ни от бобовых протопластов не удалось получить целого растения. А физиологи, занимающиеся протопластами, как раз хотят выращивать из них и пшеницу, и рожь, и ячмень, и горох, и сою… Потому, что здесь речь идет о возможности выведения таких гибридов, о которых селекционеры не смели и мечтать.

Автор: Н. Федотова.