Как происходит синтез белка

В каждой области науки есть своя «синяя птица»; кибернетики мечтают о «думающих» машинах, физики — об управляемых термоядерных реакциях, химики — о синтезе «живого вещества» — белка. Синтез белка долгие годы был темой фантастических романов, символом грядущего могущества химии. Это объясняется и той огромной ролью, какая принадлежит белку в мире живого, и теми трудностями, которые неизбежно вставали перед каждым смельчаком, отважившимся «сложить» из отдельных аминокислот замысловатую мозаику белка. И даже еще не самого белка, а только пептидов.

Разница между белками и пептидами не только терминологическая, хотя молекулярные цепи и тех и других состоят из аминокислотных остатков. На каком-то этапе количество переходит в качество: пептидная цепь — первичная структура — обретает способность сворачиваться в спирали и клубки, образуя вторичную и третичную структуры, характерные уже для живой материи. И тогда пептид становится белком. Четкой границы здесь не существует — на полимерной цепи нельзя поставить демаркационный знак: досель — пептид, отсель — белок. Но известно, например, что адранокортикотропный гормон, состоящий из 39 остатков аминокислот,— это полипептид, а гормон инсулин, состоящий из 51 остатка в виде двух цепей,— это уже белок. Простейший, но все же белок.

Способ соединения аминокислот в пептиды был открыт в начале прошлого века немецким химиком Эмилем Фишером. Но еще долго после этого химики не могли всерьез помышлять не только о синтезе белка или 39-членных пептидов, но даже значительно более коротких цепей.

Процесс синтеза белка

Для того, чтобы соединить между собой две аминокислоты, надо преодолеть немало трудностей. Каждая аминокислота, подобно двуликому Янусу, имеет два химических лица: карбоксильную кислотную группу на одном конце и аминную основную группу — на другом. Если от карбоксила одной аминокислоты отнять группу ОН, а от аминной группы другой — атом водорода, то образовавшиеся при этом два аминокислотных остатка могут соединиться друг с другом пептидной связью, и в результате возникнет простейший из пептидов — дипептид. И отщепится молекула воды. Повторяя эту операцию, можно наращивать длину пептида.

Однако эта, казалось бы, на первый взгляд несложная операция практически трудноосуществима: аминокислоты очень неохотно соединяются друг с другом. Приходится их активировать, химически, и «подогревать» один из концов цепи (чаще всего карбоксильный), и вести реакцию, строго соблюдая необходимые условия. Но это еще не все: вторая сложность состоит в том, что соединяться друг с другом могут не только остатки разных аминокислот, но и две молекулы одной кислоты. При этом строение синтезируемого пептида будет уже отличаться от желаемого. Больше того, каждая аминокислота может иметь не две, а несколько «ахиллесовых пят» — боковых химически активных групп, способных присоединять аминокислотные остатки.

Чтобы не дать реакции свернуть с заданного пути, необходимо закамуфлировать эти ложные мишени — «запечатать» на время осуществляемой реакции все реакционноспособные группы аминокислоты, кроме одной, присоединив к ним так называемые защитные группировки. Если этого не сделать, то цель будет расти не только с обоих концов, но и вбок, и аминокислоты уже не удастся соединить в заданной последовательности. А ведь именно в этом и заключается смысл всякого направленного синтеза.

Но, избавляясь таким образом от одной неприятности, химики столкнулись с другой: защитные группировки после окончания синтеза нужно удалить. Во времена Фишера в качестве «защиты» применялись группировки, которые отщеплялись гидролизом. Однако реакция гидролиза обычно оказывалась слишком сильным «потрясением» для полученного пептида: с трудом построенная его «конструкция» разваливалась как только с нее снимали «строительные леса» — защитные группировки. Лишь в 1932 году ученик Фишера М. Бергманн нашел выход из этого положения: он предложил защищать аминогруппу аминокислоты карбобензоксигруппой, которую можно было удалить без повреждения пептидной цепи.

Синтез белка из аминокислот

В течение последующих лет был предложен ряд так называемых мягких методов «сшивки» аминокислот друг с другом. Однако все они фактически были лишь вариациями на тему метода Фишера. Вариациями, в которых иногда даже трудно было уловить исходную мелодию. Но сам принцип оставался все тем же. И все теми же оставались трудности, связанные с защитой уязвимых групп. За преодоление этих трудностей приходилось расплачиваться увеличением числа стадий реакции: один элементарный акт — соединение двух аминокислот — распадался на четыре этапа. А каждая лишняя стадия — это неизбежные потери.

Если даже предположить, что каждая стадия идет с полезным выходом в 80% (а это хороший выход), то через четыре этапа эти 80% «растают» до 40%. И это при синтезе только дипептида! А если аминокислот будет 8? А если 51, как в инсулине? Прибавьте к этому сложности, связанные с существованием двух оптических «зеркальных» форм молекул аминокислот, из которых в реакции нужна только одна, приплюсуйте проблемы отделения образующихся пептидов от побочных продуктов, особенно в тех случаях, когда они одинаково растворимы. Что же получится в сумме: Дорога в никуда?

И все же эти трудности не останавливали химиков. Погоня за «синей птицей» продолжалась. В 1954 году были синтезированы первые биологически активные гормоны-полипептиды — вазопрессин и окситоцин. В них было по восемь аминокислот. В 1963 году был синтезирован 39-членный полипептид АКТГ — адренокортикотропный гормон. Наконец, химики США, Германии и Китая синтезировали первый белок — гормон инсулин.

Как же так, скажет читатель, трудная дорога, оказывается, привела не в никуда и не куда-нибудь, а к осуществлению мечты многих поколений химиков! Это же эпохальное событие! Верно, это — эпохальное событие. Но давайте оценим его трезво, отрешившись от сенсационности, восклицательных знаков и чрезмерных эмоций.

Никто не спорит: синтез инсулина — огромная победа химиков. Это колоссальный, титанический труд, достойный всякого восхищения. Но вместе с тем эго, по существу, и потолок старой химии полипептидов. Это победа на грани поражения.

Синтез белков и инсулин

В инсулине 51 аминокислота. Чтобы соединить их в нужной последовательности, химикам потребовалось провести 223 реакции. Когда спустя три года после начала первой из них была закончена последняя, выход продукта составлял меньше одной сотой процента. Три года, 223 стадии, сотая доля процента — согласитесь, победа носит чисто символический характер. Говорить о практическом применении этого метода очень трудно: слишком велики связанные с его реализацией расходы. А ведь в конечном счете речь идет о синтезе не драгоценных реликвий славы органической химии, а о выпуске жизненно важного лекарственного препарата, который необходим тысячам людей во всем мире. Так классический метод синтеза полипептидов исчерпал себя на первом же, самом простом белке. Значит, «синяя птица» вновь ускользнула из рук химиков?

Новый метод синтеза белка

Примерно за полтора года до того, как мир узнал о синтезе инсулина, в печати промелькнуло еще одно сообщение, которое вначале не привлекло особого внимания: американский ученый Р. Мэрифилд предложил новый метод синтеза пептидов. Поскольку сам автор поначалу не дал методу должной оценки, и в нем было много недоработок, выглядел он в первом приближении даже хуже существовавших. Однако уже в начале 1964 года, когда Мэрифилду удалось с помощью своего метода осуществить полный синтез 9-членного гормона с полезным выходом в 70%, ученые изумились: 70% после всех этапов — это 9% полезного выхода на каждой стадии синтеза.

Основная идея нового метода заключается в том, что растущие цепочки пептидов, которые раньше были брошены на произвол хаотического движения в растворе, теперь привязывались одним концом к твердому носителю — их как бы заставляли стать на якорь в растворе. Мэрифилд брал твердую смолу и к ее активным группам «привязывал» за карбонильный конец первую из собираемых в пептид аминокислоту. Реакции шли внутри отдельных частичек смолы. В «лабиринтах» ее молекул сначала появлялись первые короткие ростки будущего пептида. Затем в сосуд вводили вторую аминокислоту, ее молекулы сшивались своими карбонильными концами со свободными аминными концами «привязанной» аминокислоты, и в частицах вырастал еще один «этаж» будущего «здания» пептида. Так, этап за этапом, постепенно наращивался весь пептидный полимер.

Новый метод имел несомненные преимущества: прежде всего в нем была решена проблема отделения ненужных продуктов после присоединения каждой очередной аминокислоты — эти продукты легко смывались, а пептид оставался пришитым к гранулам смолы. Одновременно исключалась проблема растворимости растущих пептидов — один из главных бичей старого метода; раньше они нередко выпадали в осадок, практически переставая участвовать в процессе роста. Пептиды, «снимаемые» после окончания синтеза с твердой подложки, получались почти все одинакового размера и строения, во всяком случае, разброс в структуре был меньше, чем при классическом методе. И соответственно больше полезный выход. Благодаря этому методу синтез пептидов — кропотливый, трудоемкий синтез — легко поддается автоматизации.

Мэрифилд соорудил несложный автомат, который сам по заданной программе проделывал все положенные операции — подачу реагентов, смешивание, слив, промывку, отмер дозы, добавление новой порции и так далее. Если по старому методу на присоединение одной аминокислоты приходилось травить 2—3 дня, то Мэрифилд на своем автомате соединял за день 5 аминокислот. Разница — в 15 раз.

В чем состоят трудности синтеза белков

Метод Мэрифилда, названный твердофазным, или гетерогенным, сразу же был принят на вооружение химиками всего мира. Однако уже через короткое время стало ясно: новый метод вместе с крупными достоинствами имеет и ряд серьезных недостатков.

По мере роста пептидных цепей может случиться так, что в какой-то из них окажется пропущенным, скажем, третий «этаж» — третья по счету аминокислота: ее молекула не дойдет до места соединения, застряв где-нибудь по дороге в структурных «дебрях» твердого полимера. И тогда, даже если все остальные аминокислоты, начиная с четвертой, выстроятся в должном порядке, это уже не спасет положения. Полученный полипептид по своему составу, а следовательно, и по своим свойствам не будет иметь ничего общего с получаемым веществом. Произойдет то же самое, что и при наборе телефонного номера; стоит пропустить одну цифру — и нам уже не поможет тот факт, что все остальные мы набрали правильно. Отделить же такие ложные цепи от «настоящих» практически невозможно, и препарат оказывается засоренным примесями. Кроме того, оказывается, что синтез нельзя вести на какой угодно смоле — ее нужно тщательно подбирать, так как свойства растущего пептида зависят в какой-то мере от свойств смолы. Поэтому ко всем этапам синтеза белка необходимо подходить максимально тщательно.

Автор: В. Азеринков.