Катализ и ферменты – мостики через неживое

Мы привыкли к тому, что всё в наше время развивается гигантскими темпами. Стремительно растут всяческие скорости: движения, производства, научной информации, технологических процессов. Мы привыкли к этому и часто даже не замечаем изменений, которые произошли в нашей жизни за последние пять — десять лет. Проблем и издержек, связанных с современным технологическим развитием человечества, много. Одна из самых грозных — загрязнение окружающей среды, другая — ограниченность природных ресурсов.

Мы, химики, осознаем эти проблемы особенно остро. Трудом нескольких поколений химиков создана современная индустрия крупномасштабной трансформации молекул — химическая технология. С нею связаны многие, и лучшие и худшие, стороны современной жизни. Из лучших сторон конечно нельзя не отметить огромное развитие фармацевтики, появление штучных аминокислот, таких, как например, Аргинин. Когда находишься на современном химическом производстве и наблюдаешь за работой установки, перерабатывающей десять миллионов тонн (!) вещества в год, понимаешь, что проблемы сырья и загрязнения окружающей среды не высосаны из пальца.

И все-таки создание мощных химических производств — жизненная необходимость. Развитие общества непрерывно требует новых материалов, удобрений, топлива во все большем количестве.

Проблема, которая должна быть решена, формулируется достаточно просто — разработка мощных химических производств, новых, нетрадиционных источников сырья с уменьшением до нуля отходов производства.

Возможно ли это в принципе? Каковы пути развития химической науки и химической технологии? И есть ли выход из этого почти безвыходного положения?

Повышение мощности на языке химиков означает увеличение скорости химических реакций. Уменьшение отходов — это проведение химической реакции в нужном направлении без того, чтобы одновременно образовывались другие, ненужные вещества. Ключ к решению этих проблем — катализ. Нужны новые катализаторы — вещества, ускоряющие протекание химического процесса в нужном направлении.

С катализом человечество знакомо давно. Явление ускорения химических реакций с помощью специально вводимых веществ — предмет изучения химической науки и основа химической технологии. Краеугольный камень нынешней технологии — гетерогенный катализ — подарил человечеству массу новых химических процессов и новых веществ. Однако до настоящего времени гетерогенный катализ остается в высшей степени несовершенным. Несовершенны наши знания о нем и, самое главное, несовершенны сами катализаторы, не обеспечивающие нужных скоростей реакций и приводящие, как правило, к образованию заметных количеств побочных продуктов.

Создание катализаторов — одна из главных задач химии. Химическая технология сменила несколько поколений катализаторов. Тем не менее, остается ощущение, что эволюция катализаторов не успевает за бурным развитием потребностей общества. Есть ли в этой области новые идеи? Можно ли надеяться создать совершенные катализаторы и на их основе совершенные технологические процессы?

На эти вопросы можно ответить положительно. Да, такие идеи есть и объединить их можно общим названием — биогенизация технологии.

Без катализа нет жизни

Направленный переход одних веществ в другие — одна из наиболее характерных черт живого. Вопрос о том, по каким путям осуществляются такие переходы, уже давно занимает умы ученых.

Для биохимика жизнь при всей ее сложности, многообразии, сокровенности — лишь последовательность нескольких тысяч сопряженных каталитических реакций. Для живого характерны в основном однотипные химические изменения, посредством которых перерабатываются питательные вещества. Скорость этих изменений и природа образующихся веществ зависят от свойств биокатализаторов — ферментов, или энзимов.

Ферменты — одна из самых интригующих проблем современной науки. Биолог пытается понять механизм действия ферментов в живых клетках; физики исследуют строение биокатализаторов; наконец, химики изучают ферменты для того, чтобы понять, как они проводят химические реакции.

Столь пристальное внимание к проблеме, возникшей на стыке различных отраслей знания, привело к тому, что биокатализаторы в настоящее время изучены лучше, нежели обычные химические катализаторы. Один из парадоксов современной науки в том и заключается, что «молодые» проблемы, захватившие исследователей разных специальностей, развиваются нынче быстрее и плодотворнее, чем «классические», находящиеся под протекторатом одной какой-нибудь науки.

Живая клетка отличается от окружающей ее неживой природы тем, что в ней вырабатываются очень большие и чрезвычайно сложные молекулы. «Основная единица» жизни представляет собой высокоорганизованную «фабрику молекул». Способность синтезировать большие молекулы из более простых веществ — одна из главных отличительных особенностей живой клетки.

К числу таких макромолекул принадлежат белки. Помимо того, что белки составляют основную часть «твердого» вещества клетки, многие из них обладают каталитическими свойствами, «работают» ускорителями химических реакций, протекающих в клетке. Таким образом, по своей природе ферменты — это белковые соединения.

Последовательность аминокислот в них задана генетическим кодом. Громадная полимерная молекула фермента «весит» в 103 — 105 раз больше, чем молекула воды. Но это еще не все. Чтобы белок был ферментом, необходимо соответствующее пространственное расположение полипептидной цепи.

Последовательность цепочки — всего лишь первичная структура белка. В реальности ее трудно представить себе вытянутой в струнку. Под действием водородных связей она тут же скручивается в спирали или петли. Затем и эта вторичная структура под действием сил притяжения или отталкивания различных групп цепочки уплотняется в полипептидный клубок. Спирали и петли причудливо изгибаются, «замирая» в третичной структуре. В ней-то и сосредоточена вся неповторимость белка: именно в третичной структуре «отпечатались» его свойства.

Исследование структуры энзимов сдвинулось с места, когда был развит физический метод рентгеноструктурного анализа. Почти тридцать лет понадобилось Максу Перутцу, чтобы исследовать гемоглобин — белок, способный связывать кислород. «Секрет жизни казался мне заключенным в структуре белка»,— делится ученый из Кембриджа, удостоенный за свое фундаментальное исследование Нобелевской премии. Так думали и другие исследователи. Сейчас расшифрованы структуры многих ферментов. Построены пространственные модели их третичных структур с указанием координат всех атомов (а их число, например, в гемоглобине, достигает десяти тысяч). Наконец, удалось синтезировать первый фермент — рибонуклеазу. Но кто из химиков или физиков может сказать, что он понял, в чем основной секрет живого?

В вихре высоких скоростей…

Позволив исследовать многие ферменты, рентгеноструктурный анализ все же не ответил на главный вопрос: как работает фермент, в чем причина его каталитической активности? Дело в том, что рентгеноструктурный метод дает представление о статической, «неподвижной» структуре биокатализатора, в то время как фермент — динамическая, «работающая» система, мир высоких скоростей. В одну секунду он проводит реакцию, на которую понадобилось бы в тех же химических условиях, но без катализатора тысячи лет! Одна молекула холинэстеразы из электрического ската «перерабатывает» за одну секунду триста тысяч молекул субстрата! Обычно энзимы гораздо «мощнее» и эффективнее простых катализаторов.

Простой пример: Перекись водорода — нестабильное соединение и уже в обычных условиях превращается в воду и кислород. Этот процесс ускоряется в присутствии ионов железа. В сто раз активнее этот же процесс протекает, если ион железа перевести в комплекс с достаточно сложной органической молекулой — протопорфирином. А если этот образовавшийся комплекс, так называемый гемин, поместить в активный центр фермента каталазы, то процесс ускорится еще в десять триллионов раз! Таким образом, преимущество фермента над простыми катализаторами исчисляется астрономическими цифрами.

Наши представления о механизме действия ферментов весьма продвинулись вперед, когда они стали изучаться методами химической кинетики — науки, которая исследует скорости протекания химических процессов.

В основе действия ферментов лежат различные и достаточно ясные факторы. Самый простой из них — концентрационный эффект. Чтобы произошла реакция, нужна встреча по крайней мере двух молекул. Чем меньше в растворе молекул, тем менее вероятно их столкновение. В этом случае фермент может сыграть роль «свахи». Он «вылавливает» из раствора молекулы, сводит их вместе на своей поверхности. «Познакомившись», разноименные молекулы реагируют между собой. Такое концентрирование молекулярных пар приводит к тысячекратному ускорению реакции.

Однако не всякое столкновение между молекулами чревато реакцией. Важно, чтобы они состыковались друг с другом определенными участками своих поверхностей. Так вот, фермент не только концентрирует молекулы, резко повышая шансы на взаимные встречи, но и ориентирует каждый раз реагирующие молекулы определенным образом друг относительно друга. «Ориентационный эффект» приводит к дополнительному тысячекратному ускорению реакции.

Все реакции, катализируемые ферментами, происходят на небольшом участке молекулы фермента, составленном из строго подобранных химических групп. Это и есть «активный центр фермента» — «театр», в котором разыгрываются молниеносные трагедии, сопровождаемые разрывом старых и образованием новых химических связей. Группы биокатализатора притягивают молекулы из раствора, ориентируют их соответствующим образом и «атакуют» их. Как правило, число этих «боевых» групп фермента, непосредственно проводящих реакцию, невелико: около десятка аминокислотных остатков, из которых выстроена молекула биокатализатора.

В первичной структуре фермента они рассеяны по всей длине полипептидной цепи. Но при построении третичной структуры они стягиваются в один район молекулы, образуя активный центр. Вот почему столь важна пространственная организация фермента: основные свойства его заключены в третичной структуре. Стоит ей «расстроиться», как тут же исчезнут уникальные каталитические способности белка. Белки, не обладающие третичной структурой, не имеют активного центра.

За тысячную долю секунды активный центр способен присоединить молекулу превращаемого соединения (субстрата), провести в ней необходимые химические изменения и выбросить в среду продукты реакции. Причем атаку на субстрат он ведет одновременно несколькими группами. Согласованное взаимодействие их, ко всему прочему, тоже многократно ускоряет реакции. Таким образом, у фермента не один, а несколько мощных механизмов активации.

Присутствие фермента позволяет заменить сравнительно медленно протекающий прямой процесс несколькими более быстрыми реакциями. Биокатализатор меняет конкретный путь реакции — соединяясь с превращаемым веществом, он образует новые реакционноспособные промежуточные соединения, быстро переходящие друг в друга. В процессе превращения исходного вещества в продукты реакции в активном центре образуются чрезвычайно активные, неустойчивые промежуточные соединения фермента и субстрата, живущие тысячные доли секунды. Однако их удается зарегистрировать, идентифицировать и изучить благодаря разработанным методам исследования «быстрых» реакций. Современные кинетические способы позволяют регистрировать процессы, протекающие в активных центрах энзимов в течение одной миллионной доли секунды.

Исследование структуры ферментов и изучение скоростей катализируемых ими реакций дополняют друг друга, многое добавляют в наше знание о природе чудо-ускорителей.

«Станок с программным управлением»

Фермент обладает многими свойствами, которые обычно не встречаются у катализаторов других типов. Обычные катализаторы, например, чувствительны только к типу процесса, но мало обращают внимания на вид превращаемой молекулы. Катализаторы дегидратации спиртов образуют соответствующие продукты из любых спиртов, способных достичь поверхности катализатора.

Ферменты гораздо разборчивее. Обычно они проводят каталитические превращения только немногих молекул одного класса, обладая, таким образом, субстратной специфичностью. Причем огромное количество ферментов способно осуществлять превращение лишь одного субстрата, проявляя инертность к остальным, очень схожим по структуре молекулам.

Вопрос о том, почему ферменты так разборчивы,— одна из основных проблем современной теории ферментативного катализа. Впервые этот вопрос задал себе американский химик Эмиль Фишер. В качестве ответа он сформулировал весьма общее представление, которое получило название концепции «ключа и замка». Активный центр фермента обладает заданными геометрическими свойствами и таким распределением полярных и неполярных групп, которые позволяют пропустить к нему только молекулы со строго определенными свойствами. При этом контролируется не только химический состав реагентов, но и их пространственное строение. Еще в начале прошлого столетия Эмиль Фишер первым сформулировал качественное представление о природе специфичности: субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку.

В пятидесятые годы прошлого века английский ученый Кошланд обратил внимание на то, что ферменты способны претерпевать некоторые структурные изменения в зависимости от внешних условий и в присутствии определенных молекул. Это позволило ему постулировать гипотезу индуцированного соответствия. Согласно этой гипотезе, «хороший», специфический субстрат, взаимодействуя с ферментом, сам меняет пространственное расположение химических групп, образующих его активный центр. «Плохой» же, неспецифический субстрат таких информационных изменений вызвать не в состоянии, активный центр «дремлет», реакция не протекает.

Гипотеза Кошланда нашла широкое признание, и в ряде работ было экспериментально показано, что каталитическое действие ферментов действительно связано со структурными изменениями белковой молекулы. Однако до настоящего времени остается открытым вопрос, определяют ли эти изменения высокую специфичность ферментов. Простой ответ о природе субстратной специфичности ферментов был предложен И. В. Березиным и доктором химических наук К. Мартинеком. Вопрос можно переформулировать так: почему ферменты ускоряют превращение одних субстратов в большей степени, чем других? Сущность представлений, развитых И. В. Березиным и К. Мартинеком, состоит в следующем.

Ферменты, как говорилось, превращая субстраты в продукты реакции, образуют промежуточные соединения — недолговременные комплексы субстрата с группами, составляющими активный центр фермента. Это так называемый «комплекс Михаэлиса», впервые, обнаруженный в начале прошлого века. Как правило, образование «комплекса Михаэлиса» протекает очень быстро почти при каждом столкновении субстрата с активным центром фермента. Некоторые ферменты имеют активный центр, состоящий как бы из двух участков, различающихся по функциям. Один участок, адсорбционный, присоединяет субстрат к ферменту и образует «комплекс Михаэлиса», концентрирует и ориентирует молекулы превращаемого вещества относительно второго каталитического участка, где в боевой готовности замерли группы, атакующие определенные связи молекулы субстрата.

И вот, основываясь на «классической» для химической кинетики теории переходного состояния, химики обнаружили, что ферменты могут использовать свободную энергию, которая образуется, когда возникает связь субстрата с сорбционным участком активного центра — для лучшей «работы» другой, каталитической стадии процесса. Чем прочнее связь молекулы субстрата с сорбционным центром, тем быстрее протекает реакция превращения субстрата в продукт. Но потреблять эту энергию по назначению может только «хороший» субстрат.

Такая двухцентровая модель была подтверждена количественным экспериментом для а-химотрипсина, фермента поджелудочной железы, который играет определенную роль в расщеплении белков пищи.

Можно детально представить себе «драму» развивающихся событий. Активный центр ловит молекулы превращаемого вещества за их неполярные группы, экстратируя их из водного раствора. Последние охотно стремятся выскочить из полярной воды и прилепиться к «родной» неполярной капле. Сила, заставляющая их уходить из воды и «слипаться», носит название гидрофобного взаимодействия.

Молекула субстрата ориентируется на активном центре гидрофобными, водородными, донорно-акцепторными связями. Здесь и вступает в силу избирательность фермента: любая неполярная молекула может сесть на каплю, но только немногие будут затем подвергнуты бомбардировке его атакующими группами. Дело в том, что для этого реагирующие связи должны находиться в строго определенном месте молекулы фермента.

Таким образом, неповторимое своеобразие ферментов-биокатализаторов состоит в структуре их сложно организованных активных центров. При всем многообразии строения глобул белка строение активного центра удивительно однообразно: «щель» для «заглатывания» субстрата и несколько строго ориентированных в пространстве и друг к другу каталитически активных групп. Вещество, попадая в поле действия этих химических групп, претерпевает серию последовательных изменений по строгой программе.

Многовековой отбор и эволюция ферментов отшлифовали эту программу таким образом, что процесс перехода молекулы в продукт реакции протекает по наиболее выгодному пути, не связанному с преодолением высоких энергетических барьеров или попаданием в глубокие энергетические ямы. Вот почему фермент — это, по выражению академика Н. Н. Семенова, станок с программным управлением, настроенный на изготовление одной детали. Без такой специфичности ферментов существование жизни оказалось бы невозможным.

Первые ласточки биотехнологии

Сегодня мы являемся свидетелями явного скачка в понимании ферментативного катализа. Он не связан с каким-либо фундаментальным открытием последних лет, а подготовлен постепенным накоплением отдельных фактов, сделавших более или менее ясной всю картину в целом. Эти факты относятся к установлению состава активных центров, их третичной структуры, к выявлению «элементарных» стадий ферментативных реакций. Возникает ощущение, что явление понято. Но это не совсем верное ощущение.

Хоть нам и известны основные физико-химические закономерности ферментативного катализа и хотя мы можем качественно описать основные эффекты увеличения скоростей, но в целом явление это мы понимаем лишь на уровне наших современных представлений о природе взаимодействия между молекулами. И потому наши знания о ферментах в значительной степени поверхностны. Существует широкий круг вопросов, которые не решены. Почему ферменты «работают», образуя промежуточные соединения? Зачастую число этих соединений, «живущих» тысячные доли секунды, около десятка. Каким образом задается программа, обеспечивающая последовательность взаимодействий групп фермента с субстратом? Таких вопросов еще много, но среди них есть один — принципиальный для химии: что нужно делать, чтобы получить катализаторы, не уступающие по эффективности ферментам?

Разговор о биотехнологии — тема особая, и в этой статье осветить ее вряд ли возможно. На наших глазах возникает целая отрасль со своей программой, имеющая уже ряд успехов. В этой статье будут приведены лишь примеры из этой области.

Наметились две стратегии эксплуатации химиками науки о ферментах. Во-первых, модели. Многие химики используют современные представления о природе ферментативного катализа с целью создать аналоги ферментов. Скажем, проблема «фиксации» молекулярной азота, которая давно привлекала химиков, решается, в общем-то, моделированием некоторых черт ферментативного катализа.

Во-вторых, ферменты как эффективные катализаторы могут непосредственно использоваться для решения некоторые важных задач. Получают их обычно с помощью микроорганизмов, используя скоростной механизм биосинтеза белков, отработанный эволюцией. Развилась техника культивирования микроорганизмов. Поэтому исследователи, занятые ферментативным катализом, не терпят нужды в объекте своей деятельности.

Кроме того, при нынешней биохимической методике можно иметь в распоряжении практически чистые препараты ферментов. Таким образом, ферменты становятся распространенными и доступными катализаторами. Важно и то, что научились делать ферменты не столь чуткими к изменениям среды — стабильными и «консервировать» их, «пришивая» к твердым веществам-«ферментоносителям».

В целом наука о ферментах представляет собою любопытное и даже назидательное явление. С одной стороны, мы видели, как ощупью, неуверенно, пока еще раскрывается «внутренняя жизнь» биокатализаторов, механизм их работы. С другой стороны, химическая энзимология, ветвь этой области знания, подошла сейчас к тому рубежу, за которым и лежит решение увлекательной проблемы — использовать высокие достоинства биокатализаторов в производственных целях, в целях создания принципиально новой, биогенной технологии.

Ферментная инженерия находится в стадии становления. У нее множество своих собственных задач практического характера, связанных с синтезом надежных ферментов, удлинением сроков эксплуатации «живых» катализаторов. Тем не менее непреложным остается то, что применение ферментов сулит тот самый сдвиг в технологии, в котором так нуждается промышленность.

Фермент кормит. Фермент лечит. Экономит топливо и драгоценные металлы в истощающихся кладовых природы. Превращает обычную воду в первоклассное горючее, громоздкие крупнотоннажные химические производства — в небольшие предприятия, напоминающие лаборатории. Возможности ферментной инженерии прояснены далеко не полностью. Она еще молода, но уже подарила человечеству немало надежд.

Авторы: С. Варфоломеев, И. Магай.