Дефектний вірус раку
Стаття написана Павлом Чайкою, головним редактором журналу «Пізнавайка». З 2013 року з моменту заснування журналу Павло Чайка присвятив себе популяризації науки в Україні та світі. Основна мета як журналу, так і цієї статті – пояснити складні наукові теми простою та доступною мовою.
У 1910 році Пейтон Раус в Рокфеллерівському інституті виділив вірус із пухлини курки плімутрокської породи. Їм було встановлено, що якщо цей вірус прищепити інший курці, то виникає подібна ж пухлина. Це вже було певним доказом того, що вірус може викликати злоякісні утворення. Раус і його співробітники провели тривале, ретельне вивчення властивостей вірусу саркоми Рауса, або НБУ, як цей вірус був названий. («Саркома» — злоякісна пухлина, що розвивається з елементів сполучної тканини.)
Після тимчасового інтересу до відкриття вченого про виділений вірус згадували рідко, так як нікому не вдавалося знайти докази, що віруси викликають рак не тільки у курей, але і в інших тварин.
Однак в останні роки було встановлено, що віруси мають відношення до різних видів пухлин ссавців. Тому вчених знову зацікавив взаємозв’язок вірусів і раку. Причому увагу дослідників була зосереджена на вірус саркоми Рауса, який, порівняно з іншими пухлинними вірусами найбільш активний, так як викликає швидку і безпосередню зміну клітин, призводячи до злоякісних новоутворень.
Що ж відомо про цей незвичайний вірус, чому він сприяє розвитку раку? Встановлено, що вірус саркоми Рауса володіє унікальною здатністю трансформувати клітини. Він призводить до злоякісного переродження більшості, якщо не всіх заражених клітин. Інші ж віруси змінюють тільки невелику частину клітин або не змінюють їх зовсім. Ось чому саме цей вірус так «зручний» для дослідника.
Для випробування активності вірусу є стандартний прийом. Культура тканини готується шляхом подрібнення десятиденних курячих ембріонів. Шматочки тканини обробляються трипсином для відділення клітин одна від одноъ. Потім відмиті клітини поміщають у посудину, де вони розмножуються. Коли клітини прикріплюються до скла, в живильне середовище додають RSV необхідної концентрації. Протягом кількох днів «здорові» клітини під впливом вірусу формуються у вогнища трансформованих клітин. Клітини, взяті з цих скупчень, а потім введені в організм курки, і викликають саркому.
Легко визначити число таких осередків, які розвиваються в культурі тканини. Воно завжди пропорційно концентрації RSV, спочатку введеного в культуру. З цього можна укласти, що інфекція, що вноситься єдиною вірусною часткою, достатня для того, щоб покласти початок трансформації клітини і утворенню саркоми.
В лабораторії вірусів Каліфорнійського університету в Берклі були проведені дослідження розвитку RSV в культурі тканин. Мета досліджень — вивчити вплив вірусу на утворення пухлини. Для цього до культури — близько мільйона клітин ембріона курчати — додавали RSV в достатній концентрації. Цим самим в кожну клітину вносилася інфекція. Приблизно через 12 годин, починали з’являтися частинки нового вірусу, причому швидкість утворення вірусу протягом двох днів весь час зростала, досягаючи постійного рівня на третій день.
Якщо не поповнювати запас клітин у культурі тканин, то процес розмноження вірусів в кінці кінців різко сповільнюється і потім зовсім припиняється, після того як віруси знищать всі клітини і не буде, отже, «вільних клітин-господарів», в яких вони можуть розмножуватися. Вірус саркоми Рауса так само, як вірус лейкозу, веде себе по-іншому: не вбиває «клітину-господаря», віруси-нащадки відходять від поверхні клітини, не руйнуючи її.
Так як віруси лейкозу розмножуються таким же шляхом, як і RSV, ми не могли знайти кривої зростання RSV натяку на пояснення незвичайних, що сприяють розвитку раку властивостей цього вірусу. Однак ми натрапили на такий факт: час від часу одна з наших культур не утворювала вогнищ трансформованих клітин під впливом RSV, незважаючи на велику кількість доданого вірусу. Клітини просто відмовлялися трансформуватися або репродукувати вірус в скільки-небудь значній кількості. Після кількох таких прикрих випадків, які змусили нас відкинути ці культури як непотрібні, ми все ж вирішили, що такі випадки стійкості (резистентності) культури повинні бути досліджені.
Було встановлено, що фактором, що викликає резистентність, є інший вірус: один з групи вірусів лейкозу. Коли він виявлявся в ембріонах курчат, використовуваних для культури тканини, культури виявлялися резистентними до інфекції. Крім того, коли ми штучно заражали цим вірусом клітини курячого ембріона ці клітини також ставали резистентні до інфекції RSV. Тому ми назвали цей вірус чинником, що викликає резистентність (або RJF). Як і інші віруси лейкозу, він не виробляє видимих змін у клітинах, які їм заражені.
Виявлення вірусу — фактора, що викликає резистентність, скоро призвело до багатьох дивних відкриттів. Кілька років раніше Альфред Прінс зауважив, що колонії клітин ембріона курчати, заражених вірусом саркоми Рауса, виглядають звичайними, але утворюють дуже мало вірусів саркоми Рауса. Крім того, вони резистентні до повторної інфекції RSV. Ми подумали, що «винуватець» — тут знайдений нами вірус або який-небудь, подібний йому. Повторивши досліди Прінса, ми знайшли, що колонії клітин, заражених вірусом саркоми Рауса, дійсно виробляють велику кількість RJF, частинки якого викликають стійкість до повторного інфікування.
Що ж являє собою цей новий вірус, і звідки він виник? Адже в клітинах, які не були заражені вірусом саркоми Рауса, його виявити не вдалося. Мабуть, цей вірус проникає в клітину як супутник вірусу саркоми Рауса. Виникла нова проблема: щоб виявити новий вірус, треба було заразити ним клітини і потім ввести RSV з тим, щоб переконатися, чи стали клітини дійсно резистентними до інфекції RSV. Але як зробити такого роду експеримент, якщо невідомий вірус не міг бути щеплений окремо, а тільки разом з вірусом саркоми Рауса? Насамперед ми покладали надії на те, що створюючий резистентність вірус присутній у більших кількостях, ніж RSV. У цьому випадку, якщо б ми розбавили вірусну суспензію таким чином, що RSV не можна було б виявити, то, можливо, залишилася б ще достатня кількість іншого вірусу, щоб зробити всі клітини стійкими до нової дози RSV.
Експеримент був проведений, і початкові припущення підтвердилися. Ми отримали вірус, що викликає резистентність. Його вміст у 10 разів перевищувало вміст вірусу саркоми Рауса. Перша перевірка показала, що цей вірус є не чим іншим, як вірусом, названим нами чинником, що викликає резистентність. Але була і одна істотна відмінність між ними: більшість антитіл, які нейтралізували цей вірус, не могли нейтралізувати вірус-фактор, що викликає резистентність. Тому наступним кроком була спроба порівняти новий вірус з вірусом саркоми Рауса. Виявилося, що вони, по суті, двійники.
В імунологічному відношенні новий вірус виявився не відрізняється від RSV: він нейтралізовується в точності тими ж самими антитілами. Подібними з RSV були і інші його властивості. Але знову була і суттєва різниця: новий вірус не міг перетворювати нормальні клітини в клітини саркоми, ні курей, ні в культурах циплячих тканин. Зате він володів здатністю викликати лейкоз у курей, тобто такою здатністю, як вірус – фактор, що викликає резистентність. Тим не менш, так як новий вірус був споріднений RSV у всіх інших відносинах, його і назвали вірусом, пов’язаних з вірусом Рауса, або RAV.
Для того, щоб вивчати його більш ретельно, ми вирішили спробувати ізолювати вірус саркоми Рауса і пов’язаний з ним вірус один від одного. Застосовуючи метод так званого розведення, ми змогли довести, що RAV існує самостійно. Нам вдалося також отримати чисті раси цього вірусу. Набагато важче було відокремити вірус саркоми Рауса від пов’язаного з ним вірусу. Досліди, виконані нами, закінчилися невдачею.
Відновив ці досліди вчений Хідезабіро Ханафуса, який працював у нашій лабораторії. Почав він з розведення вірусної суспензії. Йому вдалося домогтися, щоб ця суспензія викликала тільки два або три вогнища трансформованих клітин тканини. Передбачалося, що в цій суспензії присутні близько 20 частинок RAV (тобто в 10 разів більше, ніж частинок RSV). Проблема тепер полягала в тому, щоб перешкодити RAV проникнути в клітини, трансформовані RSV. Для цього Ханафуса розробив метод захисту цих клітин за допомогою агару, що містить антисироватки, які нейтралізують активність RAV. Механізм дії полягав у наступному: твердіючий агар обмежував пересування клітин, що містять RAV, а антисироватки позбавляли активності будь-які частинки цього вірусу, звільненого з клітин.
Через сім днів, коли заражені вірусом саркоми Рауса скупчення клітин повністю розвинулися, Ханафуса збирав ці клітинні вогнища, дисперсував їх трипсином, а потім засівав для розмноження в нову культуру незаражених клітин курки. Ці трансформовані клітини з введеними в них RSV починали рости швидше, ніж нормальні клітини. Такі досліди повторювалися два рази на тиждень, при цьому трансформовані клітини багаторазово ділилися і пересівалися.
При кожному засіві клітин трансформовані вогнища перевірялися на присутність вірусу. У більшості випадків вони не містили його. Але, на наш превеликий подив, скупчення клітин не містили також і вірусу саркоми Рауса. Тим не менше ці трансформовані клітини були типовими для саркоми Рауса. Щеплені ембріонам курей або курчатам, вони викликали саркому. При цьому утворені пухлини були повністю позбавлені вірусів. Тільки в деяких випадках клітини саркоми в культурах тканин виробляли вірус саркоми Рауса, причому завжди він був присутній в них разом зі зв’язаним з ним вірусом.
На підставі такої закономірності можна було зробити припущення, що супутній вірус необхідний для розмноження вірусу саркоми Рауса. Але і це припущення вимагало перевірки. Знову супутній вірус був введений в клітини саркоми, які зовсім не виробляли вірусів. (Ми назвали їх NP-клітини, тобто клітини, що не виробляють вірусів.) З’ясувалося, що дійсно супутнє введення вірусу незмінно призводило до того, що клітини, які не виробляють вірусів, починали звичайним шляхом виробляти інфекційний вірус — саркому Рауса.
Таким чином, вірус саркоми Рауса без допомоги іншого вірусу легко трансформував звичайні клітини в пухлинні. Однак при відсутності іншого вірусу був не в змозі виробляти собі подібні. Висновок напрошувався сам собою. Мабуть, вірус саркоми Рауса — дефектний вірус, позбавлений генетичної інформації, необхідної для виробництва потомства. Тим не менш, геном (комплект генів) рибонуклеїнової кислоти вірусу саркоми Рауса передається від першого покоління заражених цим вірусом клітин наступним поколінням. Цей висновок зроблено на підставі того, що потомство більш ніж п’ятдесятого поколінь клітин, що не відтворюють віруси, відтворює вірус саркоми Рауса після додавання допоміжного вірусу.
Ми вже говорили, що головна мета досліджень — встановити причини виняткової здатності вірусу саркоми Рауса трансформувати клітини, перетворюючи їх на злоякісні. Поки вичерпного пояснення не знайдено (висловлено безліч гіпотез, розроблені методики подальших досліджень), але ми вважаємо, що ці незвичайні властивості пов’язані з дефектністю вірусу. Не виключена можливість, що ця дефектність з’явиться ключем до розгадки таємниці вірусу.
Автор: Гаррі Рубін, переклад з англійської.