Канали з молекул

Молекулярна біологія – фаворит біологічних наук. У минулому вона вивчала будову і функцію нуклеїнових кислот і багатьох білкових ферментів. Зараз ця наука стоїть на порозі нових важливих відкриттів. Одна з головних проблем на порядку денному – іонні канали. Тут – ключ до розуміння того, де і як виникають нервові імпульси, ті самі, які передають в наш мозок всі відомості про світ і, навпаки, доносять відправлені мозком сигнали до наших м’язів.

Природа сигналів мозку і механізми їх генерації були остаточно встановлені сімдесят років тому. Лідери цих досліджень – англійські вчені Ходжкін, Хакслі і Катц — стали лауреатами Нобелівської премії. Ходжкіну і Катцу було, крім того, присвоєно почесне лицарське звання. Тим самим їх заслуги були поставлені в один ряд з успіхами Ньютона, Резерфорда і квартету «Бітлз».

Результати цих, які встигли стати класичними, досліджень відомі тепер навіть школярам, тому можна дозволити собі викласти їх в короткому вигляді:

В організмі людини і тварин працює ідеальний електричний зв’язок, клітини мозку передають повідомлення імпульсами електричного струму. Нервові імпульси поширюються по нерву допомогою молекулярних ретранслюючих генераторів. Ці генератори розташовані в мембрані нервового волокна, товщина якого всього десяткова частина міліметра. Генератори живої клітини – іонні, в їх роботі використовується відмінність іонного складу зовні і всередині клітини. Іонні струми створюють нервовий імпульс і дозволяють йому поширяться уздовж нервового волокна.

Перед сучасними дослідниками стоять два основних питання: молекулярна структура іонних генераторів і принципи їх роботи. Щоб відповісти на них, потрібні об’єднані зусилля вчених різних спеціальностей.

Шлях для іонів

Відомо, що під час нервового імпульсу мембрану перетинають іони натрію і калію. Постає питання, як вони це роблять. У різний час були запропоновані дві гіпотези. Згідно з першою з них, іони можуть перетинати мембрану за допомогою спеціальних молекул-переносників. Це нагадує перевезення пасажирів у човні через річку. Молекули-переносники рухаються від одного краю мембрани до іншого, захоплюючи з собою певні іони, «квитком» для іона можуть служити його розмір і заряд. Інша гіпотеза пророкує існування в мембрані спеціальних отворів-каналів. Це молекулярний тунель для іона, що прошиває мембрану наскрізь. Але мембрана не завжди однаково проникна для іонів. Іони натрію йдуть через неї в основному під час нервового імпульсу. Значить, в каналі є «ворота» і механізми, що ці «ворота» відкривають і закривають.

Зараз ясно, що існують і переносники іонів, і канали. Але для пояснення натрієвої проникності нервових клітин гіпотеза про канали здається більш правдоподібною. Чимала заслуга в цьому належить тетродотоксину – отруті, виділеній із скалозубих риб. Риби ці живуть у всіх теплих морях.

Одним з перших європейців, які описали симптоми отруєння скалозубою рибою, був відомий англійський мореплавець Джеймс Кук. У 1774 році його корабель стояв неподалік від острова Нова Каледонія. Тубільці продали морякам невідому рибу. Кука врятувала допитливість двох натуралістів, які супроводжували його: вони так довго описували і замальовували невідому науці рибу, що на стіл її подали тільки пізно ввечері, коли їсти вже не хотілося, і до вечері ледь доторкнулися.

Молекула-пробка

Виділити тетродотоксин в чистому вигляді вдалося тільки в 1950 році. Його структура тепер детально вивчена. Отруєння тетродотоксином пов’язано з порушенням передачі нервового імпульсу. Дія отрути дуже специфічна. Вона не дає іонам натрію проникати всередину клітини, не впливаючи на потік іонів калію. Це говорить про те, що шляхи через мембрану для цих іонів різні. Тетродотоксин – надзвичайно сильна отрута: один міліграм її може вбити сім тисяч мишей. Вдалося розрахувати, якій кількості іонів натрію закриває шлях одна молекула тетродотоксину. Цифра вийшла настільки великою, що пояснити її можна тільки за допомогою «канальної» гіпотези.

Яким чином діє отрута скалозубих риб? Звернуло на себе увагу гуанідінове угруповання, яке входить в молекулу тетродотоксину. Відомо, що іони гуанідину здатні проходити через натрієвий канал. Можливо, схожа на гуанідин ділянка молекули отрути теж проникає всередину каналу, але інша частина молекули настільки велика, що застряє в каналі і міцно прилипає до його входу — приблизно так, як злегка підкріплений Вінні-Пух застряг, виходячи з дому Кролика.

За кількістю «застряглих» молекул тетродотоксину визначили кількість каналів для натрію. У різних нервових волокнах вона була різною – від трьох до 75 каналів на площі в один квадратний мікрон. Тетродотоксин був «першою ластівкою». Зараз отрут – інструментів для дослідження структури іонних каналів – відомо досить багато. Один з них «подарувала» вченим маленька колумбійська жаба. Її отрута – батрахотоксин – ламає «ворота» натрієвих каналів: після обробки цією отрутою вони вже не можуть закритися. Через відкритий батрахотоксином канал починають йти іони, розміри яких перевищують розміри іонів натрію. Цей результат говорить про тісний зв’язок між воротами каналу і його здатністю вибірково пропускати іони.

Ажурний кошик

Які молекули можуть виконувати функцію каналів або переносників? Зрозуміти це допомагають штучні бімолекулярні мембрани, які в істотних рисах схожі на мембрани живих клітин.

За даними сучасної науки, клітинні мембрани в основному складаються з білків і жироподібних речовин — ліпідів. Молекула ліпіду має два кінці. Один з них «любить» воду — утворює з її молекулами водневі або дипольні зв’язки. Ця частина молекули легко розчиняється у воді і погано — в жирах. Інший кінець воду «не любить» і завжди прагне від неї геть. Такі структури, навпаки, добре розчинні в жирах. Тому в мембрані ліпіди лежать в два шари – тікаючі від води кінці збираються разом. Полярні ж кінці звернені до водних розчинів: один назовні, а інший всередину клітини. Ця бімолекулярна структура становить основу мембрани. У неї з двох кінців частково занурені молекули білків. Але є і такі білки, які пронизують мембрану наскрізь.

Велика частина ліпідів мембран клітин тварин містить фосфор. Фосфоліпіди можна витягти за допомогою спеціальних розчинників і нанести під водою на дірочку в тефлоновій стінці. На отворі виходить плоска тонка мембрана. У ній, так само як в мембрані живої клітини, два шари фосфоліпідів. Тому вона називається БФМ – бімолекулярна фосфоліпідна мембрана. У БФМ немає білків, немає й іонних каналів. Іони натрію і калію така мембрана не пропускає.

Як же тоді змусити штучну мембрану їх пропускати? Це можна зробити за допомогою деяких антибіотиків або молекул, синтезованих за їх образом і подобою. Одні антибіотики діють як переносники іонів. Наприклад, молекула валіноміцину має структуру типу «кошика». Коли в неї потрапляє іон калію, кошик зачиняється навколо нього, і тоді всередину неї упаковуються полярні негативно заряджені кисневі групи валіноміцину, а назовні виступають слабо взаємодіючі з водою частини. Після такої перебудови молекула переносника легко переходить з водного розчину в жирну мембрану. Таким чином, антибіотик валіноміцин спочатку замінює іону калію водну оболонку, а потім переносить його через мембрану.

Цей кошик-переносник влаштований дуже точно – інші іони, наприклад іони натрію, упаковуються в ньому погано. Молекула, може бути, і рада їх перевезти, але не здатна замінити іонам натрію диполі води, з якими вони міцно пов’язані електричними силами. Синтез, вивчення структури і механізму роботи геніально сконструйованої природою молекули валіноміцину — видатне досягнення вчених.

Час життя каналу

Особливий інтерес представляють антибіотики, що споруджують в мембрані заповнену водою або підігнану для іонів пору. Останнім часом техніка вимірювань досягла такої досконалості, що дозволяє вловити, наскільки змінюється електричний опір БФМ, коли в неї вбудований тільки один канал. Такі вимірювання призвели до одного з найдивовижніших відкриттів наших днів. Виявилося, що опір штучної фосфоліпідної мембрани з одним каналом змінюється стрибками. Це пов’язано з тепловим рухом молекул, що утворюють канал. Наприклад, молекула антибіотика граміцидину А рухається в мембрані, час від часу прошиваючи її наскрізь. Іони повинні ловити момент, коли канал відкритий. Цей час називають «часом життя каналу».

Провідність мембрани, що містить багато молекул аломітицину, залежить від різниці потенціалів на мембрані. Англійці Хейден і Гладкі показали, що електричне поле на мембрані змінює не провідність одиночного каналу, а тільки час його життя. Бути може, і у каналів живих клітин «час життя» залежить від електричного потенціалу, і саме тут треба шукати причину генерації нервового імпульсу?

Щоб створити один канал з ністатину, потрібно мати десять молекул цього антибіотика. З п’яти молекул будується половинка каналу. По ній іон може пройти тільки до середини мембрани. Ністатин погано проникає через мембрану, тому його треба додавати з обох сторін. Половинки каналу сходяться – шлях для іона готовий. Так само іноді чинять при будівництві дороги: починаючи з двох кінцевих пунктів, будівельники зустрічаються посередині.

Ловці каналів

Але зрозуміти, як влаштована іонна проникність нервових клітин, можна, лише виділивши іонний канал з клітинної мембрани. А це складне завдання: ліпіди міцно утримують білкові молекули. Мембрану доводиться руйнувати. Зазвичай її розчиняють детергентами. Починається найважче. Такий розчин за різноманітністю наявних в ньому білків у багато разів перевищує асортимент великого магазину і до того ж товари не розкладені акуратно по поличках, а зібрані в купу і ретельно перемішані. Спробуй в цьому хаосі знайти потрібну тобі річ, тим більше, коли не дуже добре уявляєш, як вона виглядає…

Спочатку придумали, як виділяти канали з так званих синаптичних мембран. Синапс – це місце контакту між аксоном і нервовою або м’язовою клітиною. Аксон виділяє спеціальну речовину – медіатор. Медіатор доходить до сусідньої клітини, зв’язується з рецептором і відкриває іонні канали. Виникла ідея – витягти канал з розчину за допомогою медіатора.

Довгу тонку скляну трубку набивають крупинками з полімеру. До стінок крупинок прикріплені молекули, що нагадують медіатор. Часто ці «підставні» молекули імітують тільки частину медіатора. Через трубку пропускається розчин білків мембран. Молекули рецептора не можуть пройти повз – приймаючи штучний медіатор за справжній, вони міцно з ним зв’язуються.

Наступний етап – реконструкція каналу. Виділений за допомогою «медіаторів» білок вбудовують в бімолекулярну фосфоліпідну мембрану. Уявіть собі стан рибалки, що витягує волосінь з води. Ще хвилина, і стане ясно, яка здобич, – чи то золота рибка, чи то старий черевик. Те ж саме відчувають дослідники, коли перевіряють «виловлений» канал – як він змінює опір БФМ, які іони пропускає, що керує його проникністю. Порівнявши отримані результати з характеристиками каналу нервової клітини, визначають, наскільки успішно пройшло виділення.

Протягом декількох років багато лабораторій світу займаються виділенням каналів, що відкриваються медіатором ацетилхоліном. Досягнення в цій області великі, але повного успіху нікому домогтися не вдалося: дія деяких фармакологічних речовин на природний і виділений канал виявилася різною. Десятки лабораторій намагаються сьогодні з’ясувати причини цього не цілком вдалого виділення і реконструкції каналу.

Отруйна приманка

Основні зусилля вчених спрямовані на вивчення натрієвих каналів аксонів. Ще ніхто в світі не виділив навіть слабку подобу такого каналу. А адже саме ці утворення відіграють головну роль в генерації нервового імпульсу. Як же до такого каналу підступитися? Медіаторів, які відкривають канали синаптичних мембран, тут немає. Відповідь, тим не менш, проста. Канал можна виділити за допомогою отрути. Отрута порушує роботу каналу, міцно зв’язуючись з утворюючою канал молекулою. «Потягнувши» за молекулу отрути, можна витягнути і канал.

Отрута, отримана із змій і комах, складається з багатьох компонентів. Тому ціла отрута має різноманітну біологічну активність. Різні тести дозволяють скласти щось на зразок робочої характеристики отрути: безліч граф, заповнених цифрами, знаками і словами. Після такої перевірки отрути отримують путівку в життя. Тепер їх треба розчленувати на окремі компоненти і виділити ті з них, які діють на натрієві канали.

З отрути скорпіона виділили одинадцять нейротоксинів – фрагментів отрути, що діють на нервову систему. Всі вони виявилися невеликими білками: в їх складі не більше 60 — 70 амінокислот. У двох токсинів вже розшифрована первинна структура – послідовність, в якій пов’язані один з одним амінокислоти.

Автор: С. Мініна.