Загадка ферментної індукції

В самому кінці позаминулого століття француз Е. Дюкло описав явище, яке стало «каменем спотикання» на цілих 60 років. Явище, згодом назване «ферментною індукцією», наполегливо заважало просуванню вперед багатьох досліджень. Коротко кажучи, воно зводилося до наступного. Візьмемо клітину, яка здатна синтезувати, тобто з двадцяти, приблизно, амінокислот-блоків будувати складні ланцюги білкових молекул, наприклад ферменту А. Експериментатор, досліджуючи цю клітину, бачив, що в один якийсь момент білок А в ній не синтезувався. На другому етапі досліду в клітину вводилася речовина: вона або розщеплялася ферментом (тобто була субстратом його), або була йому близькою (тоді її називають індуктором). У відповідь клітина починала діловито виробляти фермент А. Як тільки речовина прибиралася, синтез ферменту припинявся. От і все.

Експеримент повторювали в десятках лабораторій, але становище від цього не ставало краще. Чому? Бо він суперечив загальним уявленням про білковий синтез. Вважалося: у ядрі, в хромосомах, що складаються з білка і нуклеїнових кислот, міститься інформація — відомості про білки, які клітина здатна будувати сама, і про склад цих білків. Від хромосом ця інформація передається в цитоплазму (тіло клітини), де і відбувається синтез білка. (Тепер ми вже знаємо, що інформація записана в довгих нитках нуклеїнових кислот чергуванням чотирьох речовин — азотистих основ. Відомо і те, як йде синтез білка: на ДНК хромосоми будуються її дзеркальні копії — молекули-посередники, які з ядра проникають у цитоплазму і входять до рибосоми. Тут-то А складають з амінокислотних блоків білкові молекули. Будова білка визначається будовою молекули-посередника, що увійшла в рибосому. Але все це було вивчено зовсім недавно, а раніше залишалося невідомим.)

Нарешті, останнє. Хромосоми розділені на самостійні відрізки — гени. Кожен такий відрізок керує синтезом одного білка-ферменту. Ця обставина лягла в основу формули американських вчених Бидла та Тэтума «один ген — один фермент». Ферменти — особливі білки — управляють всіма реакціями в організмі, в тисячі разів прискорюючи їх перебіг.

Але повернімося до нашого прикладу. Клітина спочатку не синтезувала фермент А. Чому? Значить, в ній немає і гена А? Пригадайте: один ген — один фермент. Потім по команді індуктора або субстрату синтез починався. Що ж, індуктор утворював новий ген в хромосомах? Але це вже було б чистою містикою! Тим більше, що таємничі перетворення на цьому не скінчились: якщо в клітину додавалася невелика кількість індуктора, то незабаром синтез білка припинявся. Значить, коли висихав запас індуктора,— ген знову зникав?!

Спочатку список ферментів, що піддалися такій індукції, був досить скромним, але по мірі розширення біохімічних досліджень, він почав загрозливо розростатися. Звичайно, у момент відкриття ферментної індукції Дюкло нічого не знав про гени. Але з часом твердження: якщо в клітині виробляються ферменти, то в ній повинні бути і гени, що дають інформацію про синтез цих ферментів — стало серйозно непокоїти вчених. Повторюю, вважалося, якщо вже спадковість наявна, то і діватися нікуди: ген неодмінно спрацює.

Але у фактів була своя логіка. Коротко її можна було б викласти так: індуктора немає — індуктор є — індуктора немає. І паралельно: синтезу немає — синтез є — синтезу немає. Ця логіка не залишала нічого іншого, як припустити: якісь невідомі регулювальники за сигналом ззовні (додавання субстрату або індуктора) включали в роботу гени, пов’язані з ферментами, і придушували їх активність при видаленні субстрату або індуктора з клітинного середовища.

Це було першою загадковою властивістю, властивою системі синтезу: ферменти вироблялися тільки за сигналом ззовні. Як же це відбувається? І друга загадка…

Серед багатьох сполук, засвоюваних бактеріями, є молочний цукор — лактоза. В його переробці беруть участь дві інші речовини — галактозидпермеаза, що регулює надходження цукру в клітину, і бета-галактозидаза, що розщеплює його. Після багатьох генетичних дослідів в хромосомі бактерій кишкової палички вдалося розшукати два гена, кожен з яких відповідає за синтез одного з цих ферментів. Вдалося знайти їх взаємне розташування на хромосомі. Ну, а після цього, як і зазвичай, генетики почали вивчати мутації, мінливість цих двох генів, іншими словами, стали досліджувати, які зміни в генах виникають і як вони позначаються на роботі клітини.

Як і належало за всіма законами, один ген відповідав одному ферменту і гени ці мутації давали.

Вчені виявили мутанти (тобто змінені гени), нездатні синтезувати пермеазу (їх позначили символом). Потім знайшли мутанти, здатні синтезувати бета-галактозидазу (їх позначили символом Z ). Потім з’ясували, як часто виникають такі мутанти. Виявилося, що кожен з них зустрічається в середньому на 10 мільйонів клітин бактерій кишкової палички. Така частота узгоджувалася з тими числами, які виходили при дослідженні інших мутацій.

І раптом серед цього благополуччя пролунав грім. Був виявлений незвичайний мутант — його позначили як 0°. Якщо він був у хромосомі бактерії, то вона виявлялася нездатною синтезувати відразу обидва ферменту: і пермеазу і бета-галактозидазу. Саме по собі це ще не здавалося чимось надзвичайним. Хоча і дуже рідко, але все ж виникають мутанти, у яких пошкоджені відразу два гена. Їх називають подвійними. Але припущення про те, що 0° — подвійна мутація, було тут же відкинуто. Частота появи мутанта Y — Ю-7 і Z — також Ю-7. (Згадайте: одна мутація на 10 мільйонів змінених генів.)

За законами теорії ймовірностей частота одночасного порушення обох генів повинна бути рівною Ю-14, тобто в десять мільйонів разів менше. На жаль, ні! Частота виникнення мутації 0° була близька до 10-7. Отже, мутація 0° не є подвійною. Але якщо так, то тоді вона не може бути нічим іншим, як самостійною зміною в хромосомі бактерії. І у неї має бути своє, самостійне місце: не в генах У і Z. Щоб остаточно прояснити справу, тепер і треба було це місце знайти. Потрібно було, схрещуючи бактерії з різними змінами в генах, визначити розташування всіх трьох мутацій в хромосомі.

Незважаючи на складність такої роботи, вона вдалася Ф. Жакобу і його співробітникам. І виявилося: мутація 0° займає своє, точно визначене місце на хромосомі бактерій, неподалік від генів У і Z. Так був знайдений особливий ген 0 з досить незвичайними якостями — його зміна виводила з ладу ще два сусідніх гена. Це відкриття лише посилювало труднощі положення. Загадковість гена 0 тепер не підлягала сумніву: ген, що впливає на інші гени, регулює їх роботу. Це було і ново і незрозуміло.

Чи не пов’язані дві загадки між собою? Чи не є вони відображенням єдиного процесу? За вирішення цих питань взялися Ж. Моно та Ф. Жакоб. Ймовірно, вони припустили, гени не однакові — одні дають інформацію про синтез ферментів і про склад — структуру кожного з них, а інші регулюють роботу перших генів.

Значить, треба розділити всі гени в хромосомах на дві групи: гени, які передають інформацію (їх назвали структурними генами), і гени, що регулюють роботу структурних генів (регуляторні гени). У нашому прикладі до структурних генів слід віднести гени У і Z, а до регуляторних — ген 0. Дослідники пішли ще далі — вони припустили, що гени регуляторної системи складаються, в свою чергу, з двох різновидів: генів-регуляторів і генів-операторів.

Жакоб і Моно не обмежилися простим поділом генів регуляторної системи на два сорти. Вони запропонували і можливий механізм роботи цих генів. Ген – регулятор, що керує синтезом речовини, названої ними репрессором. Це перша стадія. На другій стадії репрессор переміщується від регулятора до гена-оператора. Подібно ключу від замка, репрессор може відімкнути або замкнути ген-оператор і в залежності від цього запустити в хід або зупинити «машину» структурних генів. Але репрессор може з’єднатися ще з однією речовиною — індуктором. Тоді він втратить свою активність і не зможе впливати на оператор.

Можна уявити собі клітину як гігантський комбінат, де виробляються різні білки. На комбінаті безліч вузькоспеціалізованих цехів, що займаються випуском своєї продукції. Один з них — наш лактозний цех по виготовленню бета-галактозидази і пермеази. Якщо раніше вважалося, що досить тільки два агрегати (два структурних гена: по одному на кожен фермент) і все буде в порядку, то тепер, за пропозицією Ф. Жакоба та Ж. Моно, робота цеху повинна була виглядати наступним чином. Ось ген-регулятор «штампує» молекулу репрессора. Цей репрессор підходить до другого агрегату, гена-оператора, і, з’єднавшись з ним, замикає його. Оператор вимикається, але разом з ним вимикаються і всі структурні гени. З них перестає зніматися інформація і вироблення ферментів припиняється. Цех встав.

Але ось в комбінаті потрібні бета-галактозидаза і пермеаза. На територію нашого цеху надсилається індуктор. Його завдання — дати команду: «включити лактозний цех». Індуктор «хапає» репрессор, оператор звільняється від контролю репрессора, включаються і знову починають працювати установки, які виробляють ферменти. До тих пір, поки вони потрібні комбінату, в лактозний цех будуть знову і знову надходити індуктори, що зв’язують молекули репрессорів. І лише коли потреба в лактозных ферментах зникне, репрессор знову замкне оператор і цех перестане працювати. Така була робоча гіпотеза двох французьких дослідників. Вона приваблювала своєю зрозумілістю і пояснювала багато загадкових питань. Тепер треба було довести, що це не гіпотеза, а справжня теорія, побудована на міцному фундаменті фактів.

Якщо схема Жакоба і Моно вірна, то можна математично точно передбачити, що буде, якщо пошкодити ген-регулятор або ген-оператор. Якщо ген-регулятор реально існує, він, мабуть, може давати два типи змін. Перший — проста поломка, і тоді ніякий контроль з боку індукторів не вплине на систему синтезу. Репрессор більше не виробляється (адже ген-регулятор зламаний), і ген-оператор змусить структурні гени працювати безперервно. Значить, якщо виявити бактерії з постійним нерегульованим синтезом ферментів, це стане вагомим доказом існування гена-регулятора.

Але можна передбачити і другий тип порушень. Адже ген-регулятор міг не зламатися, а просто змінитися. Тоді зміниться і репрессор, причому так, щоб, втративши можливість з’єднуватися з індуктором, він продовжував би впливати на ген-оператор. У цьому випадку синтез ферментів зовсім зупиниться. Адже індуктор не зможе звільнити ген-оператор від репрессора: ключ залишиться в замку назавжди. Це перша ділянка запропонованої французькими дослідниками системи. А разом з тим парність генів могла б допомогти вирішенню теореми Жакоба.

Можна уявити собі й інший тип порушення гена-оператора. До зміненого гена нормальний репресор перестане підходити: перероблений замок не можна замкнути тим самим ключем. Настає нерегульований синтез, адже тепер ніщо не може вимкнути оператор.

Значить, теоретично можливі такі порушення регуляторної системи: ген-регулятор може вийти з ладу (і тоді клітина буде здійснювати нерегульований синтез ферментів). Або він дасть змінений репрессор (що замкне синтез назавжди). Ген-оператор також може зламатися (і тоді синтез припиниться). Або перестане приєднувати до себе репрессор (і синтези будуть йти не регульовано).

Але от біда — незважаючи на суворість логіки цих міркувань, перевірити їх на практиці було поки неможливо. Припустимо, що знайдеться мутант із зупиненим синтезом. За рахунок чого сталася зупинка: чи зміненого гена-регулятора або зіпсованого гена-оператора? Визначити це без додаткових прийомів дослідження неможливо. Так вчені встали перед необхідністю введення нових методів роботи.

Про те, як мікроби підкували мікроба…

Щоб розібратися в хитрості, застосованої Жакобом і Моно, треба відзначити основну відмінність хромосом бактерій від хромосом клітин вищих рослин і тварин. У останніх всі гени повторені двічі — вони парні. Це призводить до цікавих наслідків. Хоча обидва парних гена відповідають за одну ознаку, вони можуть відрізнятися один від одного. Один змінений (мутантен), зате інший нормальний; обидва змінені; обидва нормальні. Нічого цього немає у бактерій з тієї простої причини, що вони мають одинарну, а не подвійну хромосому, і ні про яку взаємодію парних генів у клітині бактерій не доводилося мріяти.

А разом з тим парність генів могла б допомогти вирішенню теореми Жакоба і Моно. Пам’ятайте, труднощі, з якими зіткнулися дослідники: було незрозуміло, що стало причиною одночасної зупинки синтезу ферментів — поломка оператора або зміна молекули репрессора (як наслідок зміни гена-регулятора)? А тепер уявіть собі, що вдалося б всунути в одну клітину відразу і мутанний, і нормальний гени. Якщо мутація була наслідком поломки оператора, то синтез ферментів тепер відразу відновиться і стане підкорятися контролю індуктора. Дійсно, поламаний ген-оператор так і не буде працювати, зате введення в клітину відразу б виявило місце порушення і справжнього винуватця аварії.

Ну, а якщо мутації торкнувся не оператор, а ген-регулятор? Він як і раніше буде синтезувати змінені молекули репрессорів, позбавивши їх можливості зв’язуватися з індукторами. Пам’ятаєте, ми говорили, що такий репрессор, як поламаний ключ у замку, залишився б назавжди приєднаним до оператора.

В цьому випадку — ось вона, відмінність! — введення нормального гена-оператора не зможе відновити синтез. Другий, нормальний оператор, як і перший, виявиться надійно заблокований зміненим репрессором. Як бачите, введення другого гена в клітину відразу б виявило місце порушення і справжнього винуватця аварії.

Здійснити такий дослід — об’єднати в одній клітині парні гени — допомогла робота, виконана Ф. Жакобом і Є. Адельбергом. Вони навчилися тимчасово створювати умови парності генів в бактеріях: тимчасово зливаючи нуклеїнові структури двох мікробів. Для нас зараз важливий тільки результат. Застосувавши цей метод, Жакоб і Моно почали створювати різні моделі парних генів і довели, що відбуваються поломки і оператора, і регулятора, а звідси слідував і основний висновок: ген-регулятор і ген-оператор реально існують в хромосомах і вони дійсно регулюють білкові синтези.

Коли були описані ознаки цих генів, Жакоб і Моно знайшли для них і місце на генетичних картах хромосом. Гіпотеза переросла в теорію.

Генетичні причини раку

Після робіт Жакоба і Моно в багатьох лабораторіях широко розгорнулося дослідження регуляції білкових синтезів. Зараз доведено, що великий клас реакцій, що відбуваються в різних організмах, починаючи від бактерій і кінчаючи ссавцями, підпорядковується схемі Жакоба і Моно. Мабуть, така регуляція біохімічної активності клітин притаманна всім організмам.

Виняткова важливість цього відкриття була швидко оцінена. Воно відразу ж було використано для розшифровки внутрішньоклітинних причин виникнення раку. У клітині, де порушена регуляторна система нехай навіть невеликого «білкового цеху», починається гарячковий синтез якогось одного або невеликого числа ферментів. В розлад потім приходить і весь врівноважений комбінат білкових синтезів. А як раз це і спостерігається на практиці. Було помічено, що багато видів раку — результат нерегульованих синтезів в клітині.

І ось перше слідство із теорії Жакоба і Моно. Можливо, що рак — наслідок порушення регуляторної системи генів. Але це все-таки припущення. А досліди?

В лабораторії Абелева вивчалася біохімія ракових пухлин. Стежачи за розвитком пухлин, вчені намагалися виявити в них якісь з’єднання, властиву тільки їм. Адже якщо пухлина так різко відрізняється від навколишніх нормальних тканин, то закономірно було шукати якісь тільки їй притаманні хімічні речовини. Пошуки їх увінчалися успіхом. Останнім часом був описаний білок альфа-глобулін, виявлений в пухлині печінки миші. Подібного йому не було ні в крові, ні в печінці, ні в інших органах здорових дорослих мишей.

Коли дослідники починали роботу, тільки біохімія володіла їх помислами. Але тепер вони зіткнулися з цікавою генетичною проблемою. Ми вже не раз говорили, що всі синтези в будь-яких клітинах йдуть під контролем генетичних структур. Але раз так, то в тканині печінки, яка переростала в пухлину, повинен був з’явитися новий ген, що дає інформацію про новий глобулін.

Як довести, що дійсно з’явився новий ген? Перш за все треба встановити, що ніде раніше в організмі миші не утворювалось таке з’єднання. Для цього вчені почали вивчати мишей з самих перших моментів їх розвитку, до свого здивування в ембріонах мишей вони виявили той самий альфа-глобулін, який вони вважали результатом або, може бути, навіть причиною злоякісного переродження печінкової тканини.

Але — в цьому вирішення проблеми! — такий глобулін утворювався в печінці ембріона тільки до тих пір, поки тканина печінки зростала. Росла! Як тільки ріст зупинився, іншими словами, по досягненні зрілого віку, синтез альфа-глобуліну припинявся. Зіграла свою роль регуляторна система клітини. Мабуть, репрессори придушили діяльність структурних генів, відповідальних за утворення цього глобуліну. Але ж ракова пухлина — активно зростаюча тканина. І як тільки почався злоякісний ріст, відразу ж став у відчутних кількостях утворюватися глобулін, який і був знайдений вченими.

Що ж зняло ті репрессори, які є в нормальній печінці та пригнічують в ній синтез альфа-глобуліну?

Поки невідомо, але відповідь на це питання була б великим кроком вперед у вивченні раку. Цінність теорії Жакоба і Моно аж ніяк не обмежується тільки тим, що вона допомагає розібратися в проблемі раку. Зараз ще не можна навіть передбачити всіх тих наслідків, до яких приведуть подальші дослідження з регулювання білкових синтезів.

Автор: В. Сойфер.