Зонд для клітини

Клітинна теорія стверджує, що всі живі істоти – рослини, тварини, найпростіші організми — складаються з клітин і їх похідних, що клітина — основна структурна і функціональна одиниця життя. Від успіхів у вивченні клітини залежить вирішення багатьох проблем біології, медицини та сільського господарства. Ось чому багато поколінь вчених так наполегливо досліджують будову і поведінку клітин.

Жива клітина

Як відомо, Тульський зброяр Лівша підкував механічну блоху, працюючи без «мелкоскопа». У нього було «око пристрілявши». Жива клітина, про яку піде мова, за обсягом приблизно в мільйон разів менше блохи. При хірургічному оперуванні такої клітини доводиться виконувати настільки дрібну роботу, що обійтися без спеціальної апаратури неможливо. Клітина сама має мікроскопічні розміри, а розміри її органел лежать біля меж або за межами роздільної здатності найкращих світлових мікроскопів. Природно, що успіхи тих, хто вивчає клітку і її дивовижну внутрішню організацію, залежать від досконалості методики і дослідницької апаратури, від прогресу в цій галузі.

Протягом століть, з тих пір, як в 1665 році Роберт Гук, удосконаливши мікроскоп, розглянув в нього клітинну будову зрізу, зробленого з простої пробки, цей прилад був основним і чи не єдиним інструментом при вивченні клітини. Наука про клітину довго залишалася переважно описовою. Вчені старанно збирали відомості про мікроскопічну будову самих різних клітин, вивчаючи препарати мертвих і забарвлених спеціальними барвниками тканин. У цих роботах класики мікроскопічних досліджень досягли вражаючих успіхів. Однак не можна досить глибоко зрозуміти явища життя, залишаючись лише стороннім спостерігачем. Необхідний експеримент, і зокрема хірургічний, точніше, мікрохірургічний експеримент з живою, функціонуючою клітиною.

До 30-х років минулого століття такі експерименти проводилися лише в одиничних випадках, вручну і в основному тільки з такими великими клітинами, як, наприклад, яйця жаби. Лише в 30-х роках ХХ століття були створені перші спеціалізовані механічні прилади для мікрооперацій на клітинах — мікроманіпулятори. Ці перші прилади були оснащені мікроскопом для спостереження за ходом операції і набором інструментів, гачків, голочок, мікропіпеток, мікроелектродів і т.п. для мікровимірювань, мікроін’єкцій, мікропересадок або для розсічення, руйнування або вилучення окремих внутрішньоклітинних структур.

Механічні мікроманіпулятори допомогли, та й допомагають зараз, дослідникам зібрати багато цінних відомостей про клітину та її вміст. Найчастіше з цими приладами оперують великі клітини-ікринки, амеби або, наприклад, гігантські одноклітинні водорості. Однак вдається їх використовувати і для вивчення звичайних клітин багатоклітинного організму. Для цієї мети їх найчастіше виділяють з організму і вирощують (культивують) в скляній посудині з живильним середовищем. Клітини, що осіли на дно такої судини, що прикріпилися до скла і розпласталися на її поверхні, зручно розглядати знизу за допомогою перевернутого (інвертованого) мікроскопа. Спостерігачеві доступні в такому випадку найдрібніші їх структури. Нерухому і розпластану клітку зручно оперувати, а потім можна протягом багатьох днів стежити за результатами операції. Змінюючи склад живильного середовища і вводячи в неї різні хімічні препарати, можна вивчати перебіг післяопераційних процесів в різних експериментальних умовах. У будь-який момент оперовану клітину можна вбити фіксуючою рідиною і досліджувати її стан за допомогою будь-якого з добре відомих методів, призначених для таких випадків.

Для точного проведення експерименту оператор повинен бачити оперовану клітинну структуру. Що ж однак, можна побачити в мікроскопі? Адже вміст клітини зазвичай прозорий у видимому світлі. При звичайному освітленні іноді важко навіть розрізнити обриси клітини. Однак існують різні види спеціального освітлення. Ось, наприклад, мікрофотографії культивованої клітини кенгурового щура, що ділиться. Такою ми бачимо її при фазовоконтрастному мікроскопічному освітленні, за допомогою якого вдається відтіняти окремі щільні структури навіть в абсолютно прозорому об’єкті.

На мікрофотографіях клітина показана в різних стадіях її життєвого циклу, тобто протягом усього її життя, що завершується поділом. Як влучно було відзначено, завдяки поділу клітин життя примудряється обвести навколо пальця час!

В результаті цього дивного процесу замість однієї постарілої клітини виникають дві молодих з новим запасом життєвих сил. Значення клітинного поділу настільки зрозуміло, що немає необхідності його роз’яснювати. Досить нагадати тільки, що клітинний поділ обов’язковий для самого існування і розвитку всіх живих систем, а його порушення призводять до найпохмуріших результатів. Хід подій при нормальному і патологічному розмноженні клітин давно вже тема номер один в дослідженнях медиків і біологів всіх спеціальностей, проте до сих пір механізм поділу, механізм його регуляції залишаються багато в чому незрозумілими.

Клітинний поділ досліджувався і досліджується за допомогою різних методичних прийомів. Природно, що намагалися дослідити це явище і за допомогою мікроманіпулятора. Однак найтонший механічний інструмент виявляється досить грубим в порівнянні з найдрібнішими структурами клітин. При будь-якій механічній мікрооперації доводиться проривати клітинну, а іноді і ядерну оболонку, і, перш ніж вдається дістатися до досліджуваної внутрішньоклітинної структури голками і гачками, клітині наносяться згубні пошкодження. Робота з мікроманіпулятором трудомістка і вимагає високого мистецтва експериментатора. Однак навіть самий вправний колега лесковського лівші навряд чи зможе за допомогою гачка або голки швидко і акуратно пошкодити певний хімічний компонент в певній ділянці хромосоми, що рухається в живій подільній клітині. Для вирішення подібних експериментальних завдань потрібен зовсім інший методичний прийом.

Промінь світла

У 1908 році в Мессіні, на півночі Сицилії, стався землетрус. Сергій Степанович Чахотін, який працював у той час на середземноморській біологічній станції, отримав важкі пошкодження хребта. Він нерухомо лежав у затемненій лікарняній палаті і, як годиться справжньому вченому, розмірковував про… «ідеї німецького патолога Рудольфа Вірхова про клітину і французького фізіолога Клода Бернара про значення експерименту в біології…» За його спогадами, крізь темну штору в палату проникав вузький промінь сонячного світла, що висвічував в повітрі окремі порошинки. Ось цей-то промінь і навів Чахотіна на думку про створення оригінального приладу для дослідження клітини. Ідея полягала в тому, щоб використовувати найтонший пучок світлових променів, який би проникав крізь клітинну оболонку і фокусувався в світлову пляму на будь-якій внутрішньоклітинній органелі.

Таким «променевим скальпелем», «світловим мікроуколом» Чахотін запропонував випалювати, руйнувати або інактивувати окремі клітинні структури. Ця ідея настільки проста і природна, що вона, наприклад, незалежно, при подібних обставинах виникла і у автора цих рядків, але із запізненням на п’ятдесят років.

Однак вміст клітини зазвичай прозорий, і видиме світло легко проходить крізь клітину, не викликаючи серйозних пошкоджень. Інша справа ультрафіолетове світло, невидиме оку. Це випромінювання ефективно впливає на найбільш важливі біологічні макромолекули, і, що дуже важливо, дія світла залежить від довжини його хвилі. При одній довжині хвилі можна вибірково впливати на нуклеїнові кислоти хромосом, а при іншій — переважно пошкоджувати білки. Отже, з’являється можливість як завгодно господарювати на потрібній ділянці клітини, за бажанням руйнуючи окремі хімічні компоненти.

Сергій Степанович здійснив свою ідею і створив перший прилад для мікроопромінення, назвавши його мікропроменем. Він відкрив нову область досліджень – мікрофотохірургію і виконав десятки цікавих досліджень.

У 60-х роках минулого століття, коли почався особливо бурхливий розвиток біології, і зокрема молекулярної біології, коли з’ясувалося, що вирішення найважливіших питань біології треба шукати на клітинному рівні, і коли перед дослідниками гостро постали проблеми дії на живі організми радіації різних видів, інтерес до методу мікроопромінення різко зріс. У багатьох лабораторіях світу з’явилися мікроменеві установки. У США був використаний протонний мікропромінь, що дає найтонший пучок швидких протонів, розігнаних в потужній прискорювальній установці. З’явився микропромінь електронів. У Франції, а пізніше і в США були створені прецизійні лазерні мікроменеві установки. Втім, і донині мікроменеві роботи ведуться в Англії та Японії.

Різноманітність апаратури в даному випадку викликана тим, що мікроменевий експеримент цікавий відразу з двох точок зору. Радіобіолога або фотобіолога (є така спеціальність) в першу чергу цікавлять механізми дії випромінювання. Для них цікаві тонкощі впливу променів різної природи на живий об’єкт — радіобіологи використовують головним чином іонізуючі випромінювання. Правда, будь-який радіобіологічний експеримент завжди має і загальне біологічне значення.

Для біолога ж, що вивчає клітину, мікропромінь – це тільки інструмент. Для цієї мети найбільш зручні традиційні ультрафіолетові мікропромені або мікропромені потужного лазерного видимого світла. Велика частина результатів, що представляють інтерес для біології, отримана саме з такою апаратурою.

Як же працює мікропромінь? Ультрафіолетовий мікропромінь поєднаний зі звичайним інвертованим мікроскопом, призначеним для розглядання предметів знизу. Об’єктом спостереження зазвичай є культивована клітина ссавців, що розпласталася на рівній поверхні тонкого кварцового скла, вмонтованого в донному отворі судини з живильним середовищем. Спостереження ведеться за допомогою кварцового об’єктива, що пропускає як звичайне, так і ультрафіолетове світло.

На такій установці по будь-якій клітинній структурі, помітній в світловому мікроскопі, можна нанести спрямований променевий удар. До теперішнього часу опромінено, ймовірно, все, що можна розрізнити в живій клітині. Нанести «променевий удар» стало відносно нескладно. Значно важче нині визначити мету «удару», тобто поставити завдання дослідження. Важко коректно провести експеримент, знайти спосіб виявлення наслідків променевого удару (працюючи з однією клітиною!), непросто зробити висновки і, ймовірно, ще складніше зробити правильні висновки. Для успіху необхідно, звичайно, поєднувати метод мікроопромінення з іншими сучасними методами дослідження: електронною мікроскопією, радіоавтографією, сповільненою мікрокінозйомкою і т. п. і чого ж все-таки можна домогтися за допомогою мікропроменя? Ось кілька експериментів.

Ядро або цитоплазма?

Ми зупинилися на одній з «під проблем» великої і складної проблеми — ядерно-цитоплазматичних взаємин: на тому, як вони складаються при дії на клітину радіації.

У чому причини інтересу до цього? Як вважають, саме зародження життя на Землі пов’язане з дією ультрафіолетової радіації, що грала, мабуть, не останню роль в синтезі перших біомолекул. Немає сумніву і в тому, що випромінювання як потужний мутагенний фактор і фактор зовнішнього середовища зіграли істотну роль в еволюції життя протягом мільйонів років. Існування біосфери повністю залежить від потоків сонячної радіації.

Однак далеко не всяка дія радіації корисна. Шкідливими виявляються навіть тривалі сонячні ванни, а для багатьох мікроорганізмів сонячне світло згубне. Шкідливу дію іонізуючих випромінювань людство усвідомило відразу після їх відкриття, сто двадцять років тому. У наш атомний і лазерний вік проблеми вражаючої дії випромінювань різної природи особливо актуальні. До речі, ще й тому, що воно тепер широко використовується в медичній і дослідницькій практиці.

В принципі випромінюванням будь-якого виду при достатній його інтенсивності можна вбити будь-який організм, порушити будь-який біохімічний процес і зруйнувати будь-яку біомолекулу. Однак одні тканини і органи зазвичай чутливіше інших. Вже давно доведено, що найбільш чутливими до радіації виявляються тканини з клітинами, що розмножуються, а найбільш вразливий в цьому відношенні процес клітинного розмноження. (Цей факт використовується в медицині при лікуванні онкологічних захворювань для придушення неконтрольованого розмноження клітин.) Причини надзвичайної чутливості клітин, що діляться ще не з’ясовані. Мабуть, випромінювання порушує тонкі процеси регуляції клітинного поділу. Однак до теперішнього часу самі процеси цієї регуляції багато в чому не вивчені, природно, що і про причини їх порушень можна висловлювати тільки припущення.

До сих пір залишається спірним навіть питання про те, що є найбільш вразливою і головною мішенню первинного променевого ураження,— ядро або цитоплазма. Ще в 1947 році в експериментах з тутовим шовкопрядом академік Б. Л. Астауров продемонстрував, яке виняткове значення має радіаційне пошкодження хромосом ядра. Однак є також безліч фактів, що показують, що і опромінення цитоплазми іноді згубне для всієї клітини. Наприклад, може пошкоджуватися клітинна оболонка, від стану якої залежить обмін клітини з зовнішнім середовищем; за даними останніх досліджень, ця оболонка відіграє істотну роль і в регуляції клітинного поділу.

В опроміненій цитоплазмі з’являються отрути і звільняються ферменти, отруйні і руйнуючі клітину. Опромінення може порушити роботу і енергетичного апарату клітини, що знаходиться в цитоплазмі. У цитоплазмі «поміщаються» і буддеталі «веретена» — апарату, що забезпечує поділ клітини. Дослідникам вдалося, до речі, переконатися, що мікроопромінення навіть невеликої ділянки цитоплазми згубно діє на цей апарат. Мабуть, воно здатне руйнувати життєво важливі елементи, як ядра, так і цитоплазми.

А може бути, ядерце?

У 1781 році Фелікс Фонтана писав: «подивитися в мікроскоп може кожен, але лише деякі можуть судити про бачене». Це зауваження не втратило актуальності і в наші дні. 200 років тому Фонтана побачив і замалював ядра клітин, а в ядрах — ядерця. Однак оцінити значення цих структур він, звичайно, не міг.

Подивіться на першу з вже згадуваних фотографій клітини кенгурового щура і ви побачите, що ядерця є найбільш помітними клітинними органелами. Вже до початку минулого століття ядерцю було присвячено близько тисячі наукових досліджень. Воно цікавило як біологів, так і медиків. Було помічено, що ядерця особливо великі в клітинах з інтенсивним синтезом білка, і зокрема в швидко розмножуваних клітинах. Проте, значення ядерця залишалося незрозумілим, і його довго ще називали «самою містичною органелою» клітини.

Лише відносно недавно у зв’язку з успіхами молекулярної біології була з’ясована основна функція ядерця. Тепер ми знаємо, що ядерце — це місце синтезу рибосомальної РНК і його діяльність тісно пов’язана з постачанням клітини численними рибосомами, найдрібнішими універсальними «машинами» для синтезу білка. Весь синтез білка в клітині здійснюється ними за програмами, що доставляються з ядра інформаційною РНК. Створення рибосом починається в ядерці, і лише пізніше, після складного процесу дозрівання, ці органели виявляються в цитоплазмі і приступають до роботи.

Один з перших і основних доказів участі ядерця в синтезі цитоплазматичних рибосом був отриманий шляхом порушення його діяльності мікропроменем. Ці експерименти – одне з основних досягнень техніки мікроопромінення. Але, мабуть, досі розкриті ще не всі сторони діяльності ядерця, а в його поведінці багато що ще залишається загадковим. Перед кожним клітинним поділом ядерце швидко і таємниче зникає. Від нього зазвичай протягом декількох хвилин не залишається і сліду, але як раз в цей час в клітині з’являються щільні тіла мітотичних хромосом. Після поділу хромосоми швидко зникають з виду, але в нових ядрах з’являються і зріють нові ядерця. У чому причини зникнення ядерець? Які механізми і значення цього процесу? Яка доля речовини зникаючих ядерець, з чого і як будуються нові ядерця? – ось частина питань, для вирішення яких були використані різноманітні методи дослідження, в тому числі і метод мікроопромінення.

Класичними методами було встановлено, що ядерця утворюються тільки близько деяких певних ділянок хромосом — у так званих ядерцевих організаторів. Число цих організаторів в клітині невелике і виразне. Довжина організатора становить лише десяті частки мікрона. Нещодавно Бернсу в США вдалося за допомогою найтоншого лазерного мікропроменя опромінити не тільки ядерцевий організатор, але навіть і його окремі ділянки. Цей надзвичайно тонкий експеримент підтвердив значення організатора для формування ядерця. По суті справи, в цьому експерименті була здійснена спрямована мутація, за допомогою мікропроменя була порушена робота певної групи генів в певній хромосомі.

Автор: В. Сахаров, кандидат фізико-математичних наук.